实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定副本.docVIP

本科学生实验报告 学号： 124120463 姓 名： 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12级生物技术班 实验课程名称： 酶工程实验一 教 师： 吴倩 云南师范大学教务处编印 实验一 淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定 一、目的要求 1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。 2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。 二、基本原理 （一）淀粉酶产生菌的分离 1.菌种的采集 ①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。 ②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。 2.富集培养 ①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。 ②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。 3.菌种的分离 ①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。 ②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 （二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制 1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。 2.酶活定义：在一定pH5.5、 37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。 酶活计算公式：酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W） A:样品的OD值(平均值) K:标准曲线的斜率 N:稀释倍数 5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积 T:反应时间（min） 1000:转换因子1mmol=1000μmol W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol） 3绘制标准曲线 ①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。 ②以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。 ③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量 三、器材 1试剂: 可溶性淀粉、碘、碘化钾、HCl、柠檬酸、Na2HPO4·12H2O等 2培养基: 分离、纯化培养基 3仪器: ①平皿、 三角瓶、大试管、 1mL和10mL移液枪、涂棒； ②天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。 四、操作步骤 （一）淀粉酶产生菌的分离 1.培养基的配制及灭菌 倒平板配制分离培养基 高压灭菌30min 冷却至约50℃ 倒7块平板/140mL 冷却备用 2.制备土壤稀释液 ①称取土样1g，放入9mL无菌水试管中，摇动10min，静置10min,制备得到10-1土壤稀释液； ②用无菌吸管吸出1mL土壤悬液，加入盛有9mL无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到10-2土壤稀释液； ③再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3土壤稀释液； ④以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。 3.涂布 用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5 、10-6 和10-7土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。 4.培养纯化 挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养2～3d(如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养)。 5.产淀粉酶微生物的鉴定 向平板内加入稀碘液数滴后进行观察 （二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制 1.淀粉酶产生菌的发酵 ①分离培养基（140mL）的配制： 可溶性淀粉：0.7g 蛋白胨：0.7g 酵母膏：0.7g KH2PO4 : 0.07g MgSO4?7H2O :0.02g CaCl2?2H2O : 0.08g 琼脂 : 2.8g ②配置发酵培养基200mL/组（40mL/瓶） 将纯培养得到的（透明圈最大的） 菌落接种于发酵培养基中30℃ 150r/mi