CRT_MAGE_A3重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究.pdfVIP

中国医科大学学报 第38 卷 第7 期 2009 年7 月 493 Journal of China Medical University Vol.38 No.7 Jul. 2009 · · CRT/MAGE -A3 重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究 刘新莉，陈洋，马萍 （中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳110001） 摘要：目的 构建钙网织蛋白/ 黑素瘤抗原基因-A3 （CRT/MAGE-A3）双基因重组腺病毒载体，并进行体外表达研究。方法 从表 达质粒pcDNA3/CRT 中切取目的片段CRT，定向克隆至穿梭载体pShuttle-GFP-CMV。根据Genbank 中提供的黑素瘤基因序列， 设计并合成引物，以人肺癌组织cDNA 文库为模板采用RT-PCR 技术扩增人黑素瘤抗原基因-A3 基因片段，测序后将黑素瘤抗 原基因-A3 基因片段定向克隆至穿梭载体，进而将穿梭载体克隆至Pac Ⅰ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi 。结果 目 的片段CRT 转入穿梭载体后，酶切鉴定pShuttle- （ΔGFP）-CRT 正确。人肺癌组织经RT-PCR 扩增出大小约950 bp 的基因片段， 测序证实为MAGE-A3 DNA 后，克隆至穿梭载体pShuttle- （ΔGFP）-CRT 构建穿梭载体pShuttle-CRT-MAGE-A3 ，酶切鉴定证实构 建正确。酶切穿梭载体将双基因片段克隆至腺病毒载体pAdxsi 得到Ad-CRT/MAGE-A3 病毒载体，酶切鉴定证实构建成功。转染 293LP 细胞并用Western blot 检测到其体外表达。结论 成功构建CRT/MAGE-A3 重组腺病毒载体并证实其能在体外有效表达 CRT 蛋白及MAGE-A3 蛋白。 关键词：钙网织蛋白；黑素瘤抗原基因-A3；腺病毒；基因治疗 中图分类号：R73 文献标志码：A 文章编号：0258-4646 （2009）07-0493-04 Construction and Expression of Recombinant Adenovirus for CRT/MAGE-A3 LIU Xin-li ，CHEN Yang，MA Ping （Tumor Research Institute The First Affiliated Hospital ，China Medical University，Shenyang 110001 ，China） ， Abstract ：Objective To construct a recombinant replication-deficient adenovirus for calreticulin/melanoma antigen gene-A3 and assay its expression in vitro. Methods Cut the fragment of CRT from the expression plasmid pcDNA3/CRT，then cloned the gene fragment into the shuttle plasmid pShuttle-GFP-CMV. The cDNA for MAGE-A3 was got by Touch Down RT-PCR amplification ，then it was confirmed by di－ rect sequencing. Subsequently ，subclone the fragment into the shuttle plasmid. Further，the aimed fragments were cloned into the Pac Ⅰre－ striction enzyme linearizationed adenoviral vector pAdxsi. The resulting recombinant adenoviral vector was confirmed by PCR and Western blot. Results MAGE-A3 was cor