残留干扰素对聚乙二醇化重组集成干扰素体外活性测定的影响研究.pdfVIP

残留干扰素对聚乙二醇化重组集成干扰素体外活性测定的影n向研究 罗岚1，杨华君1，刘日勇1。范开2 (1重庆理工大学化学与生物工程学院，重庆400000； 2重庆富进生物医药有限公司，重庆400041) 稀释倍数稀释后。分别测定其抗病毒活性(对WISH／VSV的保护作用)，并计算生物活性单位。以PEG-IFN·SA原 低于0．1％。结论游离IFN-SA残留量低于0．I％，且回收的峰3无抗病毒活性。因此，峰3中无游离IFN·SA可 留对活性影响。 关键词：PEG集成干扰素；残留干扰素；体外活性测定 Ot．干扰素(Interferona)是机体感染病毒时，自 藏中心，自行传代培养)，水疱性口炎病毒(vsV，中 细胞通过病毒应答反应而产生的一种低分子量的糖 国药品生物制品检定所提供，将VSV用7日龄鸡胚 蛋白。具有抗病毒繁殖，抗肿瘤生长，调节机体免疫 扩增后，收集上清液，分装，冻存于-80。C)。 反应等多种生物活性，是临床上治疗乙型肝炎等病 2样品和试剂 In— 毒疾病的一线药物…。集成干扰素(Consensus 2．1样品 terferon)是利用基因工程制备的非天然结构d．干扰 中检所国家人d．干扰素活性标准品，批号：97／ 素，具有比Ot-干扰素更强的广谱抗病毒作用，主要 04，效价：7500IU／支。 用于治疗丙型病毒性肝炎【2J。 由于普通干扰素在人体内半衰期短，在临床上 1．27mg／mL。 需反复给药，疗效低。聚乙二醇(PolythyleneGlycol PEG)化学修饰能够有效延长药物半衰期，是解决上mLo 述问题的重要途径【3J。但是在化学修饰过程中，与 2．2试剂 大分子的化学物质结合影响了干扰素分子的空间结 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、硫酸铵(分析纯，购 构，使PEG化干扰素抗病毒活性在体外有所降低。 于上海生工)，超纯水。胎牛血清(购于GIBCO)， 因此PEG化干扰素中残留的游离干扰素对其外活 性测定有一定的干扰。基于目前并无精确的方法用 补充10％的胎牛血清，测定培养液：1640培养液补 于检测残留干扰素的影响，本实验就重庆富进生物 充7％的胎牛血清，攻毒培养液：1640培养液补充 医药有限公司研制的PEG化重组集成干扰素，研究 3％的胎牛血清。细胞消化液(用PBS配制0．25％ 残留游离干扰素对PEG化重组集成干扰素体外测 的胰酶和0。02％的乙二胺四乙酸二钠，过虑除菌， 活的影响。 按l：l混合即为消化液)。染色液(取结晶紫50rag， 材料与方法 色液(取无水乙醇50mL、乙酸0．1mL，加水定溶至 1细胞和病毒 lOOmL)。 Wish细胞(人羊膜上皮细胞，购于武汉大学保3仪器 ·402· Agilentl100液相色谱仪，SHZ—C型循环水式多的细胞悬浮液，分别接种于96孔培养板中，每孔 用真空泵，过滤器，超净台，酶标检测仪，CO：培养 箱，96孔培养板。 的标准品溶液和供试品溶液加入已接种Wish细胞 4 Gel·I玎PLC分离ⅢN·SA和PEG-IFN-SA的方 的培养板中，每孔加入100止，于370C、5％CO：条件 法及验证 下培养18—24h。弃去培养板中的上清液，将水疱 Gel—HPLC色谱分离方法，在流动相：20mmPB。性口炎病毒(VSV，一80℃保存)用攻毒培养液稀释 0．15M(NH。)2S04，pH6．8。柱温：30℃，流速：