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第六章 分子发光分析法 分子荧光光度计 定义：激发态分子以辐射跃迁形式释放能量产生分子发光。 分子发光包括光致发光的荧光、磷光和化学发光光谱。 第一节 荧光分析法 1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”?? 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计 1952年，商品荧光分光光度计出现 二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生 电子激发态的多重度 激发态→基态的能量传递途径 荧光效率越高，物质发射的荧光越强 对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近1，说明?ki很小，可以忽略不计。 一般来说，kf 主要取决于化学结构，而?ki 则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。 （三）金属螯合物的荧光 大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定 不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+— Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强 荧光猝灭 荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率?f 下降称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂 碰撞猝灭—— M +?激 → M* M* + Q → M + Q +热 自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。 （四）荧光的激发光谱和发射光谱 （一）荧光分析仪器——主要由光源、单色器、 液槽、检测器和显示器组成。 1.光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发 射强度；适用波长范围宽。 荧光计中，常使用卤钨灯作光源。 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯。 2.单色器 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。 第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长? ex ，用此激发光激发液池内的荧光物质 ? ex 第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长? em。 在选定的? em 下测定荧光强度，定量分析。 3.样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。 4.检测器 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度。 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可 大大提高荧光强度。 5.读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱。 回顾 1.荧光与分子结构的关系 2.环境因素对荧光强度的影响 3.荧光的激发光谱与发射光谱 4.荧光定量基础及荧光分析仪器的构造 例：3，4 – 苯并芘 3，4 – 苯并芘为强致癌物质 例： VB2 ——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于强酸或强碱性溶液。 在低浓度情况下，I= KC，I与C呈线性关系，在pH6~7荧光最强 在430~440nm蓝光照射下，发出绿色荧光， ? em = 535 nm下测 I ，用标准曲线法测定 （二）温度对磷光强度的影响： 在室温条件下，溶剂分子热运动比较激烈，绝大多数处于激发三重态的物质分子均会与溶剂分子碰撞而失活，磷光很难产生。随着温度的降低，分子热运动减慢，磷光逐渐增强。当溶液在液氮中冷冻至玻璃状时，某些物质可以产生很强的磷光。低温磷光分析就是基于这一原理而建立起来的。 （一）样品池 盛试液的石英液槽 需放置在盛液氮的石英杜瓦瓶 内。 （二）磷光镜 利用磷光镜不仅 可分别测出荧光和磷光强度， 而且可以测出不同寿命的磷光。 三、磷光分析法应用 能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。 低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳