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荧光光谱仪 主要内容 荧光光谱仪的工作原理 荧光光谱仪的结构 荧光产生的基本原理 荧光：某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试样，再发射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光（fluorescence）。 荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与定量分析的方法。 荧光光谱法特点 灵敏度高； 用量少； 选择好； 应用范围不如吸收光谱法广； 对温度、pH值等因素变化比较敏感； 荧光分析的基本原理 1.荧光的激发光谱：固定测量波长（选最大荧光/发射波长），化合物发射的荧光(或磷光)强度与照射光波长的关系曲线。 2.荧光光谱 ：固定激发光波长（选最大激发/吸收波长）， 化合物发射的荧光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线。 3. 最大激发波长(λex)和最大荧光波长(λem) 物质分子结构与荧光的关系 具有共轭双键体系的分子 物质分子结构与荧光的关系 ②具有刚性平面结构 物质分子结构与荧光的关系 ③具有最低的单线电子激发态S1为π- π型。 ④若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加 荧光光谱仪的工作原理 对于某一荧光物质的稀溶液，在激发光的频率、强度以及液层厚度不变时，此荧光物质所发出的荧光强度与溶液的浓度成正比。由此可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。 荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，它属于发散光谱。 Fluoscence荧光分光光度计 荧光光谱仪结构 激发光源 单色器 样品池 检测器 记录显示系统 荧光光谱仪结构 仪器的使用与维护 注意事项 电源：触发电压、工作电流、稳定性 光源：启动预热、冷却重启、保持清洁 单色器：防潮、防尘、防污和防机械损伤 光电倍增管：避免高压时受到外来光线直射 样品池：清洗、插放方向、避免摩擦 个人防护 ： 避免紫外线损伤 荧光光谱仪的应用 常规分析（如定性和定量分析、化学表征、色谱流出物的检测等）； 获得分子信息（如测量分子内间距、决定键合平衡、研究结构变化等）； 医药研究（如研究膜结构和功能、确定抗体的形态、研究生物分子的异质性、评价药物的相互作用、确定酶的活性和反应、荧光免疫分析、监测体内化学过程等）； 环境监测（如水和空气中污染物的鉴别和计量等）。 * * λex λem 菲 化合物（环己烷中） 结 构 荧光效率 荧光波长（nm） 苯 0.07 283 联苯 0.18 316 对-联三苯 0.93 342 荧光光谱仪的分类 荧光光谱仪 荧光光度计 荧光分光光度计 区别：单色器色散元件的不同 FP-6500荧光分光光度计 0.208 光源 激发单色器 吸收池 检测放大系统 发射单色器 荧光分光光度计光路图 * * 荧光的发生和强度与物质的分子结构有着密切的关系。具体来讲，由于物质的结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长也不相同，利用这个特性可以定性鉴别物质。对于同种物质，用同一种波长的激发光照射可以发射相同波长的荧光。若是物质的浓度不同，则浓度大时，所发射的荧光强度亦强，利用这个性质可以进行定量分析。 *