叶绿体分离及荧光观察.pptVIP

实验四 叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的 1、通过实验，了解细胞器分离的一般原理和方法 2、了解荧光显微镜的基本结构、原理，掌握其操作方法，并观察叶绿素的自发荧光和叶绿体的间接荧光。 二、实验原理 将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小，形状，稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小，密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体是高等植物细胞中的重要细胞器，行使光合作用，将光能转化为化学能 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。 吖啶橙（Acridine Orange，AO） 是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。 三、实验用品 1、材料：新鲜菠菜或其它植物叶片 2、器材：普通离心机，组织捣碎机，电子天平，光学显微镜，烧杯，量筒，滴管，刻度离心管，纱布若干，载玻片和盖片等。 3、试剂：0.35mol/L NaCl 溶液 0.01％吖啶橙 四、实验步骤 取材→捣碎匀浆→过滤→离心→悬浮→制片→观察 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称6g 于30ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，于研钵中研磨。 将匀浆液用6 层纱布过滤，收集于100m1 烧杯中。 取滤液4m1 在1000 r/min 下离心2min。弃去沉淀。 将上清液在3000 r/min 下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。 将沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。 取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。 取一滴叶绿体悬液在无荧光载片上，再滴加一滴0.01% 吖啶橙染液染色1min，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。可见叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发出绿色荧光。 五、作业 1、画出分离后的细胞组分(注明形态的放大倍数)。 2、用0.01%吖啶橙荧光染料对叶绿体进行染色，于荧光显微镜下观察，观察到叶绿体发什么颜色荧光？说明吖啶橙与叶绿体中的什么成分结合？ * *