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叶绿素荧光研究背景知识介绍 前言 近些年来，叶绿素荧光技术已经逐渐成为植物生理生态研究的热门方向。荧光数据是植物光合性能方面的必要研究内容。目前这种趋势由于叶绿素荧光检测仪的改进而得到发展。然而荧光理论和数据解释仍然比较复杂。就我们所了解的情况来看，目前许多研究者对荧光理论不是很清楚，仪器应用仅仅限于简单的数据说明的基础上，本文在此基础上，目的在于简单明晰地介绍相关理论和研究要点，以求简单明确地使用叶绿素荧光检测设备，充分分析实验数据，重点在于植物生理生态学技术的应用和限制。 荧光测量基础 植物叶片所吸收的光的能量有三个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光。三个过程之间存在竞争，其中任何一个效率的增加都将造成另外两个产量的下降。因此，测量叶绿素荧光产量，我们可以获得光化学过程与热耗散的效率的变化信息。尽管叶绿素荧光的总量很小(一般仅占叶片吸收光能总量的1-2%)，测量却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱，其波长更长，因此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射，同时测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现。有一点需要注意的是，这种测量永远是相对的，因为光线不可避免会有损失。因此，所有分析必须把数据进行标准化处理，包括其进一步计算的许多参数也是如此。 调制荧光仪的出现是荧光研究技术的革命性的创新。在这类仪器中，测量光源是调制(高频率开关)的，其检测器也被调谐来仅仅检测被测量光激发的荧光。因此，相对的荧光产量可以在背景光线(主要是指野外全光照的条件下)存在的条件下进行测量。目前绝大多数的荧光仪采用了调制系统，同时也强烈建议选择调制荧光仪(Kate Maxwell,2000)。 为什么荧光产量会发生改变？Kautsky效应和Beyond 叶绿素荧光产量的变化最早在1960年被Kautsky和其合作者发现。他们发现，当把植物叶片从黑暗中转入光下，荧光产量瞬间上升(大约在1秒左右)这种上升可以解释为光合途径中电子受体的还原(可接受电子的受体的减少)。一旦PSII吸收光能，初级电子受体QA(质体醌)接受了电子，它将不能再接受电子，直到它把电子传递给下一级电子载体QB。此期间，反应中心是关闭的，反应中心关闭的比例导致光化学效率的整体下降，进而造成荧光产量的增长。 当叶片从黑暗条件转入光下，PSII(光系统2)反应中心逐渐关闭，这造成了叶绿素荧光产量(1秒钟之内)的上升，在此之后，荧光产量开始下降，持续大约几分钟或几十分钟，这种现象，被称为荧光淬灭。首先，电子被从PSII传递走的速率开始上升，这是由于光诱导对C代谢酶的活化和气孔开放的活化，这种淬灭被称为光化学淬灭。同时，能量转化为热能的效率也提高了，这种过程被称为“非光化学淬灭”(NPQ)。典型植物中，这两个过程变化将在15-20分钟内完成并达到稳定状态。当然这种时间在不同的植物种类之间差异明显。 荧光信号分析 为了通过叶绿素荧光产量的测量来获得植物光合性能的有用信息，我们有必要区分光化学过程与非光化学过程对淬灭的贡献的差异。通常的方法是关闭两者之一，尤其是光化学过程，这样我们就可以测量另外一种情况的影响。传统的方法是加入化学物质，如敌草隆(DCMU)，这种物质抑制PSII活动，从而把光化学降到零。现在的方法是“加光” 技术，即它允许光化学淬灭的贡献瞬时减低到零。这种方法中，使用了高光强的短持续时间的光线(光脉冲，一般在0.8秒左右)，这种方法可以在瞬间关闭PSII反映中心。假如这种闪光脉冲时间足够短的话，没有非光化学淬灭的发生，同时也没有诱导光化学效率的长期变化，那么在闪光期间，此时的荧光产量相当于没有光化学淬灭时达到的最大荧光(Fm)。如果我们把光照下荧光稳定状态(Fs)和活化光不存在下荧光产量的数值(Fo)相比较，我们就得出了光化学淬灭效率(可以理解为PSII的性能)的信息。 随着光化学效率的变化，热耗散(非光化学效率)效率也发生了改变，这取决于多种内部和外部因素。这种变化可以通过Fm值的变化来体现，和光化学淬灭不同，我们不可能阻断热耗散的发生，因此不可能测量非光化学淬灭不存在的时候叶绿素荧光的产量。因此，所有非光化学淬灭的估计严格对应于暗适应点(Fmo)。由于这个原因，我们有必要设计这样一种实验，通过这种实验，我们可以估计暗适应的非胁迫的参考点。这种需求是野外条件(通常估计Fm的黎明前的值)的主要限制。 淬灭分析 测量过程可以通过图1来很好地解释。测量开始时首先打开测量光，测量最小荧光信号(Fo)，然后给一个强闪光，测量暗适应状态的最大荧光(Fmo)。紧接着，打开活化光进行持续光照(或者利用野外自然光线进行照射)，并且每隔一个间隔，重复一次饱和闪光照射，通过这个过程，光照下的最大荧光Fm’可以测量到。闪光之前的稳态荧光称为Fs，闪光后，关掉活化光(同时给一个瞬时的远红外光线照射)可以