RFLP分析过程中应注意的几个问题.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)16(6):37-401994 荃Tk--1 -4 述 RFLP分析过程中应注意的几个问题 刘春吉 王明理 (CambridgeLaboratory,J11CentreforPlantScienceResearch,ColneyLane,NorwichNR47UJ,UK) RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism）是指由限制性切点间的插人、缺失、重排或点突变所引 起的基因型间限制性片段长度的变异．这一概念最初是由人类遗传工作者 B（otstein等1980)提出来的．该概念 提出来不久，植物科学工作者 B（eckman和Soller1983;Tanksley1983)就认识到了其在植物遗传研究和育种实 践中的应用潜力．与其它类型的遗传标记(GeneticMarker）相比，RFLP具有更多理想遗传标记应具备的特性： (1)极大的丰富性：从理论上讲，利用RFLP可以揭示不同基因型间DNA水平上的全部差异，因而，可以为各 种基因提供紧密连锁的标记．(2)共显性：大多数RFLP带型呈共显性，可容易的将杂合体和纯合体分离开来， 因而可以得到更多的遗传信息；(3)无上位性：RFLP即可起到遗传标记的作用，又不影响那些控制农艺性状基因 的表达；(4)稳定性：RFLP作为遗传标记不受环境条件的影响，不受植物发育时期的影响，没有组织器官特异 性。然而，就现有技术来讲，RFLP分析还是相当昂贵的，而且分析速度也较慢． 作为遗传标记RFLP可以广泛应用于遗传研究和育种实践中．例如：可用其鉴别品种，评估品种纯度 (Clydesdale等1982;Soller和Beckmann1983)，分离和鉴别遗传材料如（品种间代换系，非整倍体，异源添加 系，代换系等）(Hart等 1980;Law等1987);用于精确定位控制农艺性状的基因，进而可以用于育种工作中的间 接选择W（orland等 1988)；用于远缘杂交过程中跟踪染色体片段，确定染色体间的同源性 H（art1979;Gal。和 Miller1987)．通过鉴别不同的等位基因 (allele)来跟踪不同个体所具有的不同染色体片段，因而有可能用来将不 同个体的高育种价值片段整合到同一遗传背景之中，增强育种工作的可测性(B（eckman和Soller1986;1989)．同 时，近缘种属间遗传图谱的比较还可以揭示进化过程中染色体重排的细节 L（iu等 1992)．另外，基因的准确定 位将有利于基因的克隆，分离以及其后的转化研究 L（aw1988), 由于RFLP在遗传育种中具有如此重要的应用潜力，引起了植物科学工作者的极大兴趣．近几年来，基于 RFLP的研究工作取得了很大进展，到目前为止，已构建了包括水稻、小麦和玉米等多种主要农作物的RFLP 连锁图．RFLP分析涉及到基因库L（ibrary）的构建，组合的选配及数据处理等许多环节．下面按顺序介绍不同阶 段应注意的问题： 1基因文库的构建 1.1克隆片段的长度 构建基因文库首先要决定的问题是所要克隆DNA片段的长度．在各种农作物RFLP研究中，人们普遍选用 400-2000bp的DNA片段来构建基因文库．这是因为大多数高等植物的基因组主要是由重复序组成，用较长克隆 作探针，加大探测到这些重复序列的危险性，因而降低可用探针的比例．而如选用的探针过短，则会有同源序列多， 杂交信号弱的问题． 对那些重复序列较低的基因组，例如Arabidopsis，利用较大的克隆作探针则会提高检测到RFLP的频率． 1.2基因文库的种类 38 遗 传 HEREDITAS(Beijing)1994 16卷 由于构建高等植物RFLP连锁图所用克隆片段较小，因此大多选用以质粒(Plasmid）为载体的基因文库．根据 所克隆DNA来源不同，可构建cDNA或gDNA两种不同的基因文库． 从理论上讲，gDNA应比cDNA更容易检测到材料间的多态性．这是因为cDNA都是已知或未知编码基因， 或基因的一部分．相对于那些非编码区域，这些功能基因受到的选择压力较大，因此变异性应较小．而gDNA不 一定与功能基因有关，它们可以来源于编码基因，也可以来源于非编码区． 而在实践上，究竟哪类探针更为理想，结论是不一致的．在麦类作物上的研究结果表明gDNA的确比c