实验八、氨基酸纸色谱.pptVIP

实验八、 氨基酸纸色谱 一、实验目的 1．理解纸色谱法的分析原理。 2．掌握回流、过滤、纸色谱等基本操作。 3．学会用纸色谱法鉴定蛋白质水解液的主要氨基酸组分 二、实验原理 纸色谱属于液一液分配色谱。 纸色谱使用的滤纸是载体，附着在纸上的水是固定相。样品溶液点在纸上，作为展开剂的有机溶剂自下而上移动，样品混合物中各组分在水-有机溶剂两相发生溶解分配，并随有机溶剂的移动而展开，达到分离的目的。 三、器材与药品 1．器材 1号滤纸，铅笔，尺，点样毛细管，移液管(10mL)，带盖的广口瓶或用保鲜簿膜封口的烧杯(200mL)，回形针或订书钉，镊子，喷雾器，烘箱或电炉，铁台，铁圈，试管。 2．药品 各种标准氨基酸②[天冬氨酸（ASP），丙氨酸（ALA），甘氨酸（GLY），酪氨酸（TYR），脯氨酸（PRO），亮氨酸（LEU），谷氨酸（GLU），半胱氨酸（CYS）和精氨酸（ARG）]，茚三酮乙醇溶液(0.25%)。 四、实验步骤 1．色谱纸的准备 取一张20×10厘米的长方形Whatman 1号滤纸（只能握此滤纸之顶部边缘），置于一张清洁的纸巾或练习本纸上，放置时“×”①要在右上角。从滤纸的两个下角各剪去一块1厘米的方块。距纸底约1.5厘米处用铅笔（勿用钢笔）画一直线。沿此线用铅笔标出十个间距均匀的点，第一个点距左侧3厘米。在实验记录本中记下点样顺序，把姓名写在色谱图的右上角。 2．点样 在点实际的色谱图之前，可先在前面剪下的滤纸上练习点样技术⑥。然后，用点样管分别把每个样品点在原点上，让这些点完全风干后，再在同一点上点第二次。水解产物应点三次。展开之前让各点完全干燥。 3．展开 用移液管吸取适量80%苯酚⑦到200mL带盖的广口瓶或用保鲜簿膜封口的200mL烧杯中。移入时要小心，不要溅到瓶壁。将滤纸卷成一个大圆筒，使滴点线在底部且在筒的内面，滤纸顶部重叠0.5厘米并一定要保证底边平齐，用回形针夹起来或用订书针钉在一起。把圆筒塞入展开室内，使纸的底端浸没于展开剂中，盖上塞子，待溶剂展开至离滤纸顶端边缘0.5厘米处时，取出色谱纸（勿用手指），并立即用铅笔标出溶剂前沿。注意展开时不要移动展开室。 4．显色 待色谱纸溶剂风干后，用喷雾器均匀地喷洒0.25%茚三酮乙醇溶液于滤纸上，然后置滤纸于110℃烘箱中烘5min显色，或用小火烘至斑点出现。 用铅笔画出所有斑点的轮廓，量出每个样品从原点到斑点的距离及到溶剂前沿的距离。计算每个样品的Rf值。对照标准氨基酸的Rf值确定头发蛋白水解产物的主要氨基酸组成。记录实验结果。 五、注意事项 1、“×”在裁纸时就应标在长方形色谱纸上。由于纸的厚度略为有些不均匀，这样做记号的目的是确保学生用的每张色谱纸上的溶剂流向都一样，使Rf值更有重复性。 2、每10mL这些0.1 mol·L-1标准氨基酸溶液用10滴6 mol·L-1盐酸加以酸化。 3、拿时如不加留心，指印会同显色的斑点一起在色谱图上显出。 4、点样时斑点要点得愈小愈好，点好的斑点直径应小于2毫米，并且不能过量。否则会造成展开后的斑点拖尾或相互复盖。 六、思考题 1．? 为什么可用缩二脲反应检验蛋白质水解是否完全？ 2．? 为什么可用茚三酮作为氨基酸的显色剂 * * *