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胃蛋白酶原激活的动力学和机制 作者 译者： 摘要 胃蛋白酶原的自身活化和由胃蛋白酶催化的活化都已经被观测并进行了动力学分析。在恰当的蛋白浓度（≤1mg/ml）下，pH值介于1～3时，观测到动力学一级反应，这暗示存在一种胃蛋白酶原分子内激活机制。一级反应的证实依据是胃蛋白酶原的对数与时间作图为线性，并且该直线与纵坐标的交点是初始胃蛋白酶原浓度的对数。此外，对蛋白浓度进行十倍稀释并不减小胃蛋白酶原活化的半衰期。一级反应的速度常数 4.7/分钟（28℃）与实测的胃蛋白酶水解合成肽的催化常数（kcat）相当。 pH为4时，我们的观测符合混合反应机制，即包括胃蛋白酶与胃蛋白酶原参与的双分子反应和一种分子内活化反应。pH低于3时，通过密切观测胃蛋白酶原的初始活化率来研究这个二级反应过程。比较一级反应和二级反应的反应速率随pH变化的模型发现，随着pH的增加，一级反应的反应速率下降的明显快于二级反应的。这一事实说明发生了从pH为4时以分子间活化为主到pH低于3时以分子内活化为主的转变。 前言 两种胃内酸性蛋白酶，胃蛋白酶和胃凝乳酶，也像胰腺中性蛋白酶胰蛋白酶一样，具有自我活化的能力。在三个例证中，都是从酶原的氮端分裂一个肽后，产生一个稍小且具有活性的酶分子。至于胃蛋白酶原，在活化时会从胃蛋白酶原上分裂下一个包含至少有41个氨基酸残基的肽。 关于胃蛋白酶原活化反应的动力学研究最早是由Herriott离体条件下用结晶的酶原做的。他发现在pH为4.6时，动力学数据与一个自身催化率的表达式一致-dA/dt=k2A（Af-A），其中A是时间为t时的胃蛋白酶原浓度，Af是最终或活化后胃蛋白酶的浓度，k2是二级反应速率常数。另外，pH为1.0时的活化速率大约是pH为4.6时的100倍。Herriott的动力学数据在pH小于4时具有一种混合反应的特征，但是他也证明了pH小于4时自身催化反应是可能存在的，因为补充胃蛋白酶提高了胃蛋白酶原的活化速率。 除了需要有胃蛋白酶参与的自身催化作用外还应至少有一种其它的活化机制，因为长期储存在pH大于7.0的条件下的胃蛋白酶原在pH降低后能很容易地活化，而胃蛋白酶在pH大于7时已发生不可逆的失活了。其它两种活化机制已经被提出。一种是说一个酶原分子可能催化另一个酶原分子活化，这是一种不同于自身催化作用的一个二次动力学过程。凝乳酶原和胰蛋白酶原可能具有这种活化机制的能力。第二种是可能存在一个分子内的活化机制，这种动力学一级反应过程是可能的，并且已经在胃蛋白酶原活化上被提出。Bustin和Conway-Jacobs已经表明琼脂糖结合的胃蛋白酶原也能被活化，推测可能就是通过分子内活化机制。最近，因为有一个关于活化过程中分开的结合物的残基鉴定的证据，Stepanov等赞成一种双分子活化机制。后来，已证实在pH 2.0时胃蛋白酶原活化会生成一个色谱性同源产物，而pH 4.0时会有色谱性不同源产物。这看起来也支持存在不同的活化机制。 因此，我们设计试验再调查胃蛋白酶原活化的动力学，希望证实分子内活化机制确实存在，并且研究为什么随着pH的变化胃蛋白酶原活化的主要机制会改变。试验结果表明，pH小于3并且胃蛋白酶原浓度小于1mg/ml时，其活化的主要方式是分子内机制。pH为4时，胃蛋白酶原的活化是自身催化作用和分子内活化的混合反应过程。我们对于pH影响分子内活化和自身催化时的速率常数的研究也为解释pH变化改变活化主导机制提供了思路。 试验步骤 材料 本研究应用的猪胃蛋白酶原依据色谱原理用葡聚糖凝胶G-200和DEAE-纤维素柱提纯商业样品而得。少数的对比试验是用色谱法纯化的胃蛋白酶原完成的。晶体胃蛋白酶也是色谱制备。 测定蛋白水解活性的血红蛋白来自于牛血清白蛋白。血红蛋白制成冻干粉储存。新鲜的血红蛋白枸橼酸钠溶液（20mg/ml ，pH 2.2）是每天现配。其它的化学试剂全是来自于商品化的最高纯度，无需纯化直接应用。 活化试验中，使用的不同pH溶液如下：pH 1.0，0.1M KCl；pH 1.4，0.1M KCl；pH 2，0.1M枸橼酸钠。三种溶液均用盐酸将pH调准。pH 3和4的缓冲液是用合适比例的0.1M枸橼酸钠和0.1M柠檬酸配制。 方法 胃蛋白酶原纯化——粗制的胃蛋白酶原放于pH 7.5 、0.02M Tris-HCl缓冲液。将这些溶液置于预先平衡好的葡聚糖凝胶G-200的层析柱。用相同条件的Tris-HCl缓冲液洗脱。具有高潜力比活性的胃蛋白酶被混合收集。 混合部分再用装有DEAE-纤维素柱的色谱仪分离，用具有线性盐梯pH 7.5的0.02M Tris-HCl和0.6M NaCl＋0.02M Tris-HCl洗脱。具有一致的比活性峰的部分出现在最高浓度为0.27M NaCl时，该部分被收集、低压冻干，作为后续试验的原材料。酶原的