茯苓液体发酵最佳条件的研究.pdfVIP

题目: 茯苓液体最佳发酵条件的研究 学生姓名: 蒋朝波 学 号: 指导老师: 王剑峰 专 业: 生物技术 二○一○年九月十日 摘 要: 通过摇瓶培养实验,对茯苓生长曲线进行了初步摸索,并进一步 对茯苓液体发酵的最适培养基和培养条件进行了初步探讨。 关 键 词: 茯苓;液体发酵;发酵条件 茯苓[ Poria cocos wolf ]属食药两用的大宗药材, 目前茯苓全国年需用量达 17000 吨左右。传统的茯苓栽培法仍是茯苓目前生产的主要方法,但该法也明显 存在一些缺点,如生产周期长,产量也不高,且松材消耗量大。另外,以松木为原 料客观上存在资源制约问题,不可能年年大种植,再加上茯苓窖种容易受到白蚁 的危害,使茯苓产量和质量都难有较大的提高[1 ] 。而用液体发酵培养及分离 提取等新技术来生产茯苓,可较好地解决人工种植茯苓的替代问题[2～3 ] ,节 省了大量的木材,对我国资源和生物多样性的保护有着重要的意义。液体发酵培 养生产茯苓可连续性地进行规模化工业生产,大大缩短了生产时间,降低了生产 成本[4 ,5 ] 。同时,还可以有效地解决固体培养中白蚁等的危害及重金属超标 的难题,严格控制药材质量。 1 材料和方法 1．1．1 供试菌株 江西农科所茯苓( Poria cocos) 冷藏菌种,4 ℃低温保存, 6 个月转管1 次。 1．1．2 培养基 1．1．2．1 母种斜面培养基的配制 土豆(去皮) 20 % ,葡萄糖20 g ,琼脂20 g ,pH 自然。 1．1．2．2 种子培养基的配制 葡萄糖20 g ,酵母浸膏4 g ,蛋白胨5 g ,K HPO 1g ,水1L 。 2 4 1．1．2. 3 摇瓶发酵培养基的配制 葡萄糖25 g , 酵母浸膏3.15 g , 蛋白胨4.15 g ,K HPO 1 g ,水1 L 。 2 4 1．1．3 接种和培养 2 在250 mL 三角瓶装入50 mL 液体种子培养基,接种2 块0.15cm 等量茯苓菌块, 培养温度为25 ℃,摇瓶转速为150 r/ min 的培养条件下进行摇瓶培养5 天。用 已灭菌的移液管吸取菌液0.17 mL 于已灭菌的EP 管,再加入0.13 mL 已灭菌的 甘油,混合均匀后, - 70 ℃低温保存。在250 mL 三角瓶装入50 mL 液体种子培 养基,按0.15 %的比例接种冷冻甘油菌,25 ℃摇瓶振荡培养2 天作为液体菌种备 用。在250 mL 三角瓶装入50 mL 液体摇瓶发酵培养基, 以7 %的比例接种液体 菌种, 培养温度为25 ℃,培养基初始pH 值为515 , 摇瓶转速为150 r/min 的培 养条件下进行摇瓶培养,摇瓶培养时间为7天。 1.1.4 分析测定 1.1.4.1 菌丝干重 取发酵液50 mL ,经6000 r/ min 离心15 min ,收集沉积的菌丝球60 ℃烘干至 恒重,用精密天平称重。 1.1.4. 2 pH 值测定 pH 计(Mettler Toledo 320 pH Meter) 计测定。 1.1.4.3 还原糖含量Glu 血糖由GOD - PAP 法检测试剂盒,BECK2MAN DU640 核酸及蛋白质分析仪测定。 2.1.2 培养基的初步摸索 2.1.2.1 氮源试验 在1 L 含有25 g 葡萄糖的摇瓶发酵培养基中,分别单独加入酵母浸膏、蛋白 胨、NH Cl 、(NH4) SO 、KNO 为氮源,氮源浓度为0.11 %。通过液体摇瓶培养, 4 2 4 3 比较其生成的菌丝体重量来来确定最佳氮源。结果表明(见表1) 2.1.2.2碳源试验 以等量酵母浸膏和蛋白胨作为氮源,当氮源浓度固定在0.11 %时,探讨了7 种不 同种类碳源对茯苓菌丝生长的影响。结果表明(见表2) 2.1.2.3 碳源浓度试验 以酵母