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分子生物学 杨孝朴 第七章 基因工程 基因工程兴起于20世纪70年代初。1972年Berg P和他的同事将λ噬菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40DNA中，首次构建出DNA的重组体。由于SV40能使动物致癌，出于安全的考虑，这项工作没有进行下去。第二年，Cohen S和Boyer H将细菌质粒通过体外重组后导入宿主大肠杆菌细胞内，得到基因的分子克隆，由此产生了基因工程。 基因工程是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。基因工程这个术语既可用来表示特定的基因施工项目，也可泛指它所涉及的技术体系，其核心是构建重组体DNA的技术，因此基因工程和重组体DNA技术有时也就成为同义词。 1 基因工程工具酶 1.1 DNA限制酶 Arber W等早在20世纪50年代就己发现大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制系统，至60年代后期始证明存在修饰酶和限制酶，前者修饰宿主自身的DNA，使之打上标记;后者用以切割无标记的外来DNA。1970年Smith H O和Wilcox K W从流感嗜血杆菌中分离出特异切割DNA的限制性核酸内切酶，简称为限制酶。 1973年Smith和Nathans提出修饰一限制酶的命名法：取分离菌属名的第一个字母，种名的前两个字母，如有株名也取一个字母，当一个分离菌中不只一种酶时，以罗马数字表示分离出来的先后次序。修饰性甲基化酶标以M；限制酶标以R。例如，Smith等最初分离到的限制酶因是第2个分离出来的酶，应称为R·HindⅡ，但R通常都省略不写；相应的甲基化酶则为M·HindⅡ。又如，从大肠杆菌E.coil RY13中分离到的甲基化酶为M·EcoRⅠ，限制酶为EcoRⅠ 。限制酶的发现为切割基因提供了方便的工具，DNA重组才得以成为可能。 修饰一限制酶主要有三种类型： 类型Ⅰ酶为多亚基双功能酶，对DNA甲基化和切割由同一酶完成。该酶共有三种亚基，S亚基为识别亚基，识别位点分为两部分序列，中间隔以一定长度的任意碱基对。例如，EcoB识别序列为TGAN8TGCT，EcoK识别序列为AACN6GTGC。M亚基具有甲基化酶活性，R亚基具有限制酶活性，可在远离识别位点至少lkb以上处随机进行切割。 当类型Ⅰ酶特异结合在识别位点上时，如果两条链均已甲基化则不发生反应，对半甲基化DNA（即一条链甲基化，另一条链末甲基化），可使末甲基化的链甲基化，在识别位点上两条链均末甲基化，则DNA被酶切割。 由于切割是随机的，这类酶在基因操作中并无实际用途。 类型Ⅱ酶的修饰和限制活性由分开的两个酶来完成。通常这类甲基化酶由一条多肽链组成，限制酶由两条相同的多肽链组成。类型Ⅱ酶的识别序列常为4～6bp的回文序列。甲基化酶能使半甲基化DNA识别位点上特定碱基甲基化，DNA两条链都已甲基化时无反应，两条链都末甲基化则被限制酶降解。限制酶的切割位点或在识别位点内，或靠近识别位点。 类型Ⅱ酶是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶。 类型Ⅲ酶为两个亚基双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割。切割位点在识别位点下游24～26bp处。 大部分限制性核酸内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征，不同的限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况： 由不同微生物分离得到的限制酶，如果识别位点和切割位点完全一样，称为同裂酶；如仅仅是黏性末端突出的单链相同，称为同尾酶。由同尾酶切割的限制片段彼此相连，不能再被原来的限制酶切割。 例如： BamHⅠ的位点与限制片段 BglⅡ的位点与限制片段 连接后的序列 与原来两个限制酶的识别序列均不相同，因此不能再为原来的酶所切割。 限制酶的生物学功能在于降解外来的DNA，自身DNA的酶切位点由于修饰酶的甲基化而受到保护。在基因工程操作中限制酶可作为切割DNA分子的手术刀，用以制作DNA限制酶谱，分离限制片段，进行DNA体外重组等，是十分有用的工具酶。 限制片段常用凝胶电泳或高效液相层析（HPLC）法分离。 如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔隔256bp出现一次该酶的识别切割位点（44），识别六或八核苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔4kb（46）或65kb（48）出现一次识别切割位点。按此可大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可能具有的切点频率，以便选用合适的内切酶。 1.2 DNA连接酶 DNA连接酶可将DNA相容末端彼此连接。实验室使用的DNA连接酶有两种，T4DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶，前者以ATP提供连接所需能量，后者以NAD+提供能量。T4DNA连接酶可以连接黏性末端，也可以连接平末端；大