分子生物学_许晓东_5课件.pptVIP

5 分子生物学研究方法（上） ——DNA、RNA及蛋白质操作技术 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。 5.1 重组DNA技术回顾 三大成就 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 5.2 DNA基本操作技术 核酸凝胶电泳技术 细菌转化与目标DNA分子的增殖 聚合酶链反应技术 实时定量PCR 基因组DNA文库构建 5.2.1 核酸凝胶电泳技术 5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 5.2.3 聚合酶链反应技术 5.2.4 实时定量PCR 5.2.5 基因组DNA文库的构建 从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小的片段，分别与载体连接，转入受体细菌或细胞，形成克隆。这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库。 5.3 RNA基本操作技术 总RNA的提取 mRNA的纯化 cDNA的合成 cDNA文库的构建 基因文库的筛选 5.3.1 总RNA的提取 RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。 异硫氰酸胍法（TriZol）原理： TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 5.3.2 mRNA的纯化 5.3.3 cDNA的合成 5.3.4 cDNA文库的构建 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 步骤：在获得高质量的 mRNA 后，反转录合成cDNA，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。 5.3.4 基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有： 核酸杂交法 PCR筛选法 免疫筛选法 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 5.5.1 RACE技术 RACE（rapid amplification of cDNA ends, cDNA末端快速扩增）是一种获得转录本5‘或3’未知序列的方法。它根据已知序列设计基因片段内部特异引物， 用cDNA进行PCR扩增得到目的