β-catenin基因转染毛囊干细胞实验研究.pdfVIP

4．GMCSF对创面愈合影响的细胞分子学的机理研究 5．GMCSF凝胶在糖尿病患者烧伤创面的应用 研究结果 1．GMCSF基因缺失小鼠创面愈合明显延迟，用ELlSA法和免疫组织化学法动态检测创面愈合过 噬细胞)的早期浸润的明显下降。创面胶原的含量和血管化程度均显著降低。 2．糖尿病小鼠较野生小鼠创面愈合明显延迟，伴有早期炎症细胞浸润量和功能的下降，并发现 GMCSF的变化趋势与炎症细胞相同。提示GMCSF可能是创面局部炎症细胞量和功能调控的重要物 质。 3．外用GMCSF具有明显促进刨面愈合的作用，尤其对糖尿病小鼠创面。GMCSF外用可以部分逆 转创面局部的炎症反应。 4．体外研究进一步证实，GMCSF具有趋化炎症细胞的作用，并对刨面修复细胞成纤维细胞具有促 进其增殖和胶原蛋白表达的作用。 5．使用GMCSF凝胶具有明显促进烧伤患者创面愈合的作用，尤其是对伴有糖尿病的烧伤创面 研究结论 1．GMCSF是创面愈合重要的细胞因子，GMCSF可能通过趋化炎症细胞、促进修复细胞增殖和功 能从而加快创面愈合 2．GMCSF对伴有糖尿病的创面修复具有更大的优势 p-catenin基因转染毛囊干细胞的实验研究 杨鹏高 方勇 胡孝辉 上海交通大学医学院附属第三人民医院烧伤整形科，上海201900 严重皮肤缺损如严重大面积烧伤创面的修复仍是目前临床工作的重点和难点。毛囊干细胞因其具 有高增殖和多向分化的潜能备受创伤修复及组织工程领域学者的关注。近年来，关于毛囊干细胞的研究 取得了一定的进展。但是，迄今为止距离将其作为大量提供给组织工程化皮肤的来源、或常规的用于临 床治疗的来源仍有很大的困难，其主要原因是对毛囊干细胞的认识仍不够完善，尤其是对如何调控和诱 导毛囊干细胞增殖和分化的机制尚不明确，缺乏有效地培养及诱导毛囊于细胞增殖的措施及手段。因 此，探讨调控毛囊干细胞增殖的信号途径及分子机制，找寻一种促进毛囊干细胞体外大量增殖的有效途 径，无疑将为进一步诱导其定向分化并最终推动创伤修复及组织工程化皮肤研究的发展具有重要的理论 意义。 许多研究证明，Wnt／p-catenin信号通路是一条控制细胞命运及组织器官形态发生的重要通路。p 的研究国内外鲜有报道，如果能够通过干预毛囊于细胞内pcatenin的表达促进其增殖，无疑将为构建组 织工程皮肤提供充足的种子细胞。本研究通过构建p-catenin慢病毒载体，进而转染毛囊干细胞，观察其 对毛囊干细胞增殖的影响，以期为进一步诱导毛囊干细胞定向分化和构建组织工程皮肤奠定重要理论基 础。 315 实验方法 本研究通过中性蛋白酶一胰蛋白酶消化法分离人毛囊干细胞，结合低钙角质细胞无血清培养基培养； 间延长其表面标志物变化；倒置显微镜下观察细胞贴壁、增殖的形态学特征；选用MTT法和罗丹明B-硫 酸尼罗蓝染色法分别检测人毛囊干细胞的增殖特性及克隆形成能力；用p半乳糖苷酶染色法检测人毛囊 干细胞衰老程度。 自行构建p-catenin—EGFP融合基因慢病毒； 后毛囊干细胞的增殖活性；罗丹明B和硫酸尼罗蓝染色法检测感染前后毛囊干细胞克隆形成能力；免疫 荧光染色法检测感染后毛囊干细胞8l—integrin表达情况。 研究结果 中性蛋白酶一胰蛋白酶消化法可获取数目多，活力高的毛囊隆突部细胞，经体外培养，共可传10代。 细胞4,20天增殖最为活跃，3周后增殖能力开始下降。早期毛囊干细胞呈明显克隆性生长，细胞克隆 VS 形成能力明显高于角质细胞对照组(159．67士12．75 oA-4-5．78％vs 乳糖苷酶染色阳性细胞数明显高出对照组(第2代)细胞(70．10 0．17％-4-0．05％，P0． 01)，到第8代近100％细胞阳性。 PCR及测序鉴定证实目的基因正确克隆至慢病毒质粒中，目的基因序列与GENEBANK报道一致， 经测定，病毒滴度为2．0×108TU／mL。 感染后3w效率仍可达80％一90％；从第3d开始，感染组各个时相点较对照组毛囊干细胞增殖能力均有 grin表达较对照组明显减低，提示毛囊干细胞有分化趋势。 结论 1、中性蛋白酶一胰蛋白酶消化法结合低钙K—SFM培养