链霉菌sp.139编码糖基转移酶的Ste7基因与编码天冬酰胺合成酶Ste10基因在依博素生物合成中的功能研究.pdfVIP

链霉菌sp．1 39编码糖基转移酶的Ste7基因和编码天冬酰胺 合成酶Stel 0基因在依博素生物合成中的功能研究 自利平李元 中国医学科学院医药生物技术研究所邮编100050 电话：010 E-mail：bailipin9956@sohu．COm 链霉菌是在工业上常用的微生物之一，能产生大量的次级代谢物，主要有抗 生素，酶抑制剂，药物激动剂和除草剂等，然而有关链霉菌多糖产生、性质及生 物合成研究除本实验室外国内外尚未见报道。本实验室利用重组的I型白细胞介 素l可溶性受体(sIL—IR)为靶点建立其拮抗剂筛选模型，筛选到链霉菌菌株139， 它能够分泌一种新的胞外多糖(EPS)依博素，该多糖由半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、 岩藻糖、木糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖组成。药效学研究证明依博素对类 风湿性关节炎有明显疗效，并且毒性较低，目前已申报临床研究，有可能发展为 一种新型的临床药物。 基因簇。为了通过组合生物学研究依博素结构与生物活性关系并获得新型依博素 衍生物，拟对不同开放阅读框(ORF)的功能进行深入研究。本文选择了Ste7和 StelO基因为研究对象。 Ste7基因的大小为1，215 根据Blast比较，发现Ste7基因编码的蛋白与不同来源的糖基转移酶具有很高的 or 同源性。该类糖基转移酶催化UDP，ADP，GDP CMP连接的糖基转移至作用底物， 包括糖原，6一磷酸果糖，脂多糖。推测Ste7在依博素的生物合成中，参与了糖基 转移至多糖重复单元增长链的过程。 本研究采用基因同源双交换方法获得Ste7基因缺失株，在此基础上研究该 转移至链霉菌139原生质体，于28℃恒温培养20小时使原生质体再生后，在培养 皿上覆盖一层含有apramycin(浓度为100pg／m1)的0．7％软琼脂，由于重组质 粒pKC7LR是温度敏感型质粒pKCl139的衍生型质粒，它带有一个来自 Streptomycesghanaensis的温度敏感型复制子，34℃稳定生长，高于34℃不能 复制，而野生型链霉菌139在高达37℃的条件下仍能正常生长。所以先将转化培 养皿置于28℃培养2天，待麻点状菌落出现后再于37C继续培养7天，然后挑 选阳性菌株进行Kmr抗性筛选，得到Km’Am3的菌株，此菌株应是Ste7基因阻断株。 进行Southern杂交以验证所获菌株确为Ste7基因缺失株。对阻断菌株发酵，进 行胞外多糖分离纯化，对该多糖进行单糖组分和生物活性分析，并与依博素进行 比较，初步了解EPS一级结构变化与生物活性的关系，并确证Ste7在依博素生物 合成中的作用。 StelO基因的大小为l，935 bp，编码一个644-aa的蛋白，分子量为70．41KD。 75 根据Blast比较，发现StelO基因编码的蛋白与不同来源的天冬酰胺合成酶具有 很高的同源性，推测Stel0基因的产物可能参与依博素的修饰。 通过与构建质粒pKC7相同的方法构建了阻断质粒pKCIO，经结合转移将质 粒pKCIO转移至链霉菌139原生质体中，于28℃恒温培养20小时使原生质体再生， 采用与Ste7基因相同的方法使基因发生同源双交换，获得StelO基因阻断株，进 胞外多糖分离纯化以及该多糖的单糖组分和生物活性分析，并与依博素进行比较， 确证StelO基因在依博素产生过程中的所起的作用。 为了确证StelO基因编码的蛋白是天冬酰胺合成酶，对StelO基因进行PCR O。 Stel0，在IPTG诱导下进行表达。经SDS分析，确定其表达。采用Ni2+一螯合 亲合柱(组氨酸亲合柱)对表达产物进行纯化并进行酶学反应，确证其为天冬酰 胺合成酶，同时进行相关的酶学参数(Km值、最适PH、最适温度)分析，目前本 工作正在进行中。