细胞生物学5课件.pptVIP

一、分裂指数测定 二、MTT法测细胞活力 （一）、原理 体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。 分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 （二）、仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：CO2培养箱、普通显微镜、细胞培养皿、盖玻片、吸管 2、试剂：培养液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液 附：Giemsa染液配制： 称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。56℃中保温90—120分钟。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。 使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。 （三）、操作步骤 1、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 2、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。 3、取出盖片，按下列顺序操作： PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。 4、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 5、计算: 分裂细胞数 分裂指数= ×100% 总细胞数 注意事项：操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。 二、MTT测细胞活力 （一）原理 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐( MTT,噻唑蓝)为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四唑盐环开裂，生成蓝色的甲瓒（formazan）结晶，结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。 还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（SDS，pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。 也可以用DMSO来溶解，测定490nm的OD值。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候关闭超净台上的日光灯来避光。 （二）操作步骤 1、接种细胞 2、培养细胞 3、呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS，pH=7.4配）20ul，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 （三）注意事项 1、选择适当的细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 * * 实验四 一、分裂指数测定 Giemsa染色也是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。Giemsa染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。 *