重组DNA技术2之表达系统.pptVIP

重组DNA表达系统天津科技大学生物工程学院罗学刚 体外表达：无细胞表达系统 原核表达系统：大肠杆菌表达系统等 体内表达： 酵母表达系统 真核表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 动物/植物表达系统（转基因动物/植物） 体系选择 研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物 一、体外表达系统（无细胞表达系统） 体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表达系统而言的开放型表达系统。 优点：内源型mRNA干扰很小，操作程序简单，获得重组蛋白周期很短。主要用于蛋白质快速分析鉴定；基因转录和翻译调控机理研究；分子间的相互作用的研究。 缺点： 昂贵； 操作要求高； 表达量不够高。 主要的体外表达系统： 1、兔网织红细胞系统，由新西兰大白兔制备。 2、麦胚提取物系统，可稳定地表达一些在兔网织红细胞中翻译受到抑制的DNA。 3、原核体外翻译系统（S30原核体外翻译系统）， E.coli S30提取物由OmpT内切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制备，所以在S30系统中表达基因可以增加产物的稳定性。 目前多家公司有商业化产品，常见的有： RTS E.Coli 系统; RTS100 wheat germ CECF系统 (Roche) TNT?快速偶联转录/翻译系统 (Promega)； Gold TNT? T7 Express 96系统 （Promega），该系统有SP6和T7两种类型，适合在96孔板上进行大规模高通量筛选分析； TNT ? T7 Quick for PCR DNA (promega)，PCR DNA 的TNT ? T7快速系统从PCR反应液中直接取样，无需纯化DNA，直接用于偶联的转录/翻译反应； TNT ?偶联小麦胚芽抽提系统 (promega)。 二、原核表达系统 （一）大肠杆菌表达系统 特点：产量高、生长速度快、操作容易、成本低。 缺点： 翻译后加工修饰体系不完善：无糖基化、酰基化等 一般表达获得的蛋白常常以变性状态存在，不具有生物学活性。 目前较常用的表达载体是具有可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高，表达量可占细菌总蛋白的25％以上。 T7RNA聚合酶来源于T7噬菌体，期活性高于大肠杆菌RNA聚合酶很多倍，而且较少发生转录中止 它只识别自己的启动序列，不能启动大肠杆菌DNA的转录，对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的条件下，使目的基因得到大量扩增 正常大肠杆菌并不表达T7RNA聚合酶，为了能利用T7启动子表达外源基因，将T7RNA聚合酶基因置于lacUV5启动子控制下，整合到大肠杆菌染色体，构建了能被IPTG诱导表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株 常用宿主细胞有BL21（DE3）、JM109（DE3）等 还有受温度变化诱导的具有λ噬菌体PL启动子调控 的载体等。 大肠杆菌表达载体分类 常见的大肠杆菌商业化表达系统有： 1、pET system and pETBlue? system（Novagen公司），是原核蛋白表达中应用最多的系统。具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌。目前共有包括40多种载体、15种不同宿主菌和配套齐全的用于有效检测和纯化目标蛋白的相关产品。 基本结构由T7启动子、核糖体结合位点、信号肽序列、多克隆位点、T7转录终止信号、氨苄青霉素抗性基因核质粒复制位点等 有可以表达N端融合、C端融合和非融合蛋白的不同质粒。也可以表达非分泌性蛋白 2、pBAD表达系统（Invitrogen公司），可控制蛋白质的生产水平低于其成为不溶性蛋白的域值。通过与硫氧还蛋白的融合来增加溶解度 3、QIAexpress Expression System（Qiagen公司 ）。 常用表达载体 特殊的表达用菌株 外源基因在原核细胞中的表达形式 按表达蛋白的部位分： 分泌表达； 外周质及膜上表达 ； 胞内表达。 融合基因的表达 外源基因在大肠杆菌中表达的一种简