鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法建立应用.pdfVIP

鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光定量RT—PCR 检测方法的建立及应用 吴志明1，闫若潜1，孔刚锐1：李文山2，赵明军1，王东方1，赵雪丽1，陈慧娟1 靳利粉1 (1．河南省动物疫病预防控制中心郑少I,I河南450008；2．鹤壁市动物疫病预防控制中心，河南鹤壁，458030) 设计特异性引物和TaqMan MGB实时荧光 MGB荧光探针，经优化反应条件，建立了鉴别印，／LP—PRRSV--重TaqMan real-time 定量RT—PCR(fluorescent quantitative 重组质粒分别重复扩增3次，重复结果良好；对25份临床疑似PRRsV感染样品进行了应用检测，阳性检出率为92％， 较二重RT．PCR方法阳性检出率高。 MGB荧光探针i检测；应用 关键词：高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征；实时荧光定量二重RT-PCR；TaqMan and 猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiverespiratory and 耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiverespiratoryvirus， syndrome 主要以母猪繁殖障碍、早产、流产和死胎，仔猪及育成猪呼吸系统症状为主要特征，除可引起仔猪死 亡外，其它猪常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状错误!未找到引用源。。2006年7月以来， HP—PRRS在我国广泛流行，临床上以发热41℃以上、皮肤发红、严重呼吸道症状、母猪繁殖障碍、仔 猪及育肥猪高发病率、高死亡率为特征，是近年来对养猪业危害最为严重的疫病之一错误!未找到引 用源。。 流行，且往往和HP—PRRSV混合感染，大大加剧了猪只的死亡错误!未找到引用源。：同时该病与猪传 染性胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌、猪瘟等多种猪病在临床症状上也难以区分，且多混合感染；因此单靠 临床诊断和血清学检测方法很难确诊。本研究根据HP—PRRSV和LP-PRRSV的非结构蛋A2(Nsp2)基 因序列差异，设计特异性引物及TaqMan 以为临床鉴别诊断HP／LP—PRRS病提供快速、敏感、特异的鉴别诊断方法。 1材料与方法 1．1材料 I-1．1主要仪器和试剂ABI Fi 动核酸提取仪购自Thermo 购自岛津公司；凝胶成像分析系统购自AlphaInnotech公司：磁珠法核酸全自动提取试剂盒购自 Ambion生物科技公司；Ex TaqDNA聚合酶、dNTPs、质粒小量提取试剂盒、DNA回收试剂盒、工 作者简介：吴志明(1964一)，男，河南太康人，博士，主要从事动物疫病防控技术研究。 通信作者：吴志明。E-mai l：wuzhimin96@sina．eom： 481 pGEM—Teasy载体均购自Promega公司。 细胞第5代毒，病毒含量106．6TCID50／mL。低致病性PRRSV 汉科前动物生物制品有限责任公司产品；ST传代细胞源猪瘟(CSFv)活疫苗毒株为广东永顺生物制 质粒后，通过紫外可见光分光光度计测定其D260nm和D280nm值，重复5次，确定质粒DNA的纯度 X 和浓度，定量并稀释至1．0 1010拷贝／nL，-20℃保存备用。疑似PRRS感染病料由河南省动物疫 病预防控制中心实验室保存。 1．2方法 1．2．1 的部分Nsp2基因序列比对特征，采用PrimerExpress3．0软件分别设计特异性引物对(P1／P2)和 Taqman 公司合成。 于PCR扩增或--20℃冻