抗狂犬病毒单克隆抗体研制应用.pdfVIP

抗狂犬病毒单克隆抗体的研制及应用 廖园园，刘汉平，王威，彭杏，刘洁，朱薇，秦红刚，漆世华，温文生 (武汉中博生物股份有限公司，湖北武汉430070) vi 摘要：应用杂交瘤技术获得4株分泌抗狂犬病毒(Rabiesrus，RV)单克隆抗体细胞株，并对其特性进行分析。经 rectl衄unofluoreseent 鉴定，它们所分泌的抗体类型为IgGl，腹水效价为l：105一l：107，ELISA法和间接免疫荧光(indi 应。将这些单抗腹水进行ProteinG亲和层析纯化后获得的纯化抗体用于制备反相亲和层析柱，并以反相亲和层析法纯化RV 以获得高纯度RV抗原。应用纯化的RV建立胶体金免疫层析法(gold—immnochromatographyassay，6ICA)检测Ry抗体血 清，结果显示，GICA与标准ELISA法比较的总符合率为96．1％。 关键词：狂犬病毒；单抗；反相亲和层析；胶体金：免疫层析 狂犬病是由狂犬病毒(Rabiesvirus，RV)引起的人畜共患传染病，其主要宿主为犬、猫等动物，典型 症状为恐水症(又称恐水病)。本病极为凶险，病死率几乎为100％u1。我国是狂犬病的高发国家，居世界第 二位，仅次于印度姑。。根据部分区域调查，我国家犬带毒率为8％～15％旧1，外观健康犬脑内带毒率约15％， 对人类的健康造成很大威胁HI。狂犬病目前无有效治疗药物，疫苗接种是预防的有效办法，但是疫苗接种后 是否产生有效的保护抗体，开展免疫抗体水平监测是评估疫苗效果的方法之一，也是动态监测动物免疫效 果的主要途径。为建立敏感、特异、快速的检测方法，提高检测结果的可靠性，本研究建立了分泌RV单克 纯化RV建立胶体金免疫层析法(601d-i衄unochromatographyassay，GICA)，以此来检测RV抗体血清。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1RV抗原及其抗体制备狂犬病毒aG株悬液接种到已长成单层的Vero细胞上，35℃培养5～6d后， 甲醛灭活病毒。将灭活的病毒悬液32149离心30min去沉淀，上清通过Sepharose4FF层析柱进行纯化而 获得所需狂犬病毒纯化抗原； 自制Rv抗原常规免疫体格健壮的6月龄未接种过任何疫苗的比格犬，待犬血清中抗狂犬病毒IgG抗体 000以上，即可采血分离血清。分离的血清通过辛酸一硫酸铵沉淀法进行纯化 用ELISA方法检测效价达1：1 获得所需抗RV抗原纯化抗体．， 3eHCl·4H20) ProteinGHP和CNBr一-activated4Fast 分析纯购自Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒，HiTrap Sepharose 要设备有：荧光显微镜、C0z孵箱、酶标仪、蛋白纯化系统、点膜仪等。 1．2免疫动物8周龄BALB／C雌性小鼠购自武汉生物制品研究所动物中心。纯化RV加等量CFA充分乳化， 皮下多位点免疫BALB／e小鼠，间隔3周用减半计量加IFA腹腔加强免疫，融合前3d以首次免疫同剂量不 加佐剂腹腔加强注射。 作者简介：廖园园，女，硕士，主要从事动物病毒体外诊断试剂的研究工作。E·mail：amyylll@163．COIn。 ·--——773·-。—— 第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 接免疫荧光法筛选，有限稀释法连续克隆3次∞3，阳性孔细胞体外连续传代4个月。 1．4单抗类和亚类测定用抗原依赖分型法间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清中小鼠免疫球蛋白类及亚 类。 1．5杂交瘤细胞染色体检测 方法按参考文献[7]进行。 1．6单抗腹效价测定按常规方法畸3制备腹水，ProteinG柱亲和层析纯化抗体，用间接ELISA法和间接 免疫荧光法测定腹水效价。 1．7单抗特异性测定 1．7．1 照、人白蛋白对照和犬六联疫苗(犬温热病，犬细小病毒病，犬钩端螺旋体病，传染性肝炎，传染性支气 管炎和副流感病)包被板对