传染性法氏囊病病毒检测系统实验研究.pdfVIP

传染性法氏囊病病毒检测系统的实验研究 王忠灿1，唐雨德1，王永山”，L_if-良1，欧阳伟3 (1．南京军区军事医学研究所南京军区疾病预防控制中心，江苏南京210002；2．江苏 省农业科学院兽医研究所国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014；3． 南京农业大学动物医学院南京210095) 【摘要】为了建立传染性法氏囊病病毒(IBDV)检测系统，本研究在同一个实验技术平台上对9 种IBDV检测方法进行了比较分析。IBDV野毒株盲传4～5代可适应于鸡胚和鸡胚成纤维细胞，死亡胚 体水肿、出血，病变细胞圆缩、脱落。4个血清1型IBDV毒株，用交叉中和试验可进一步分为3个血 心抑制ELISA和中和试验四种方法同时检测不同来源血清样品中的IBDV抗体，其它三种方法比AGP 具有更高的敏感性，敏感度相差104倍。用AGP检测法氏囊组织样品，抗原效价可达到1：10，而细胞 RT-PCR／SSCP检测和病毒分离五种方法检测，均为阳性。作者还对检测系统的研究进行了分析评述。 【关键词】传染性法氏囊病病毒(IBDV)；检测；系统 Bursal 传染眭法氏囊病(Infectious BursalDisease Disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Virus，IBDV)引起的以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官一法氏囊为主要特征的传染病，该病不 但引起患病动物死亡，而且还导致机体免疫抑制，使机体的免疫防御能力降低和疫苗免疫接种失败。发 现IBD已有近50年的历史，由于采用了以疫苗免疫接种为主的综合性防控措施，有效地控制了该病的 大规模流行和爆发，但未被消除，至今仍是危害养鸡业的重要传染病之一，这表明IBDV以免疫逃避等 多种方式在自然界中继续存在[1，2]。曾经在一个比较长的时期内，认为鸡是唯一自然感染IBDV的动物， 但后来的流行病学和生态学研究表明，麻雀、鸭、鹅等可自然感染IBDV，在一定时期内成为病毒携带 者或贮存宿主，为IBDV在疫区长期滞留和变异提供条件，感染IBDV的非鸡禽鸟类通常不表现临床症 状【1，3，4]。IBD的流行特点决定了对该病的防控将是一项长期的工作。 蛋白由A片段编码的多聚蛋白加工而成，VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白，构成病毒衣壳，VP2相 对含量较多，中和抗原表位主要存在于VP2上，在VP2上已经发现多个构象依赖性中和抗原表位，用 构象依赖性中和抗原表位诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV感染。VP4为病毒自身蛋白酶， VP5的功能尚不明确。IBDV基因组的结构特点决定了该病毒具有RNA病毒共同的高度变异性【6，7]。 在上世纪80年代的中后期，在一个比较短的时间内，在世界范围内爆发了在抗原性和致病性等方面与 流行趋势的回顾性研究表明【4，9．1 段进一步发生重配的结果，A片段起源于普通的经典毒株，而B片段可能来自其它毒株。因基因突变 现出多样性和复杂性，增大了IBD的免疫防控难度。据此预测，另一形式的IBDV变异株将会再次出 现爆发，对此应做好应对准备，因此及时准确的检测报告IBD疫情是一项无容置疑的重要工作。 可分为病毒分离、免疫学和病毒核酸三个层面，这些方法在敏感性、特异性、实用性以及可操作性上存 在着差异。由于这些方法是在国内外各自独立的实验室中建立的，因此尚未形成一个完整的IBDV检测 系统。本研究旨在同一个实验技术平台上，比较分析病毒分离、血清型分析、抗体检测、抗原与核酸检 测等技术的应用，为建立完善的IBDV检测系统积累经验。 1．材料与方法 鸡法氏囊组织物和粪便各1 病毒(MDV)细胞培养物各1份。 1．2病毒的分离 1．2．1样品处理在病毒分离时，对IBD病鸡法氏囊组织物和粪便样品需采用以下方法处理：将IBD 病鸡的法氏囊组织，制成1：4组织乳剂，经V1、鼻接种于40d龄SPF来航鸡，4d后取感染鸡法氏囊， 匀浆，冻融3次，10000 体积的PBS，搅拌，7000r／min离心30 NaCl，40c沉淀12～24h，10000r／min离心40 mL经口、 rain，弃上清液，用适量PBS悬浮沉淀物，取2 鼻途径感染40d