猪繁殖和呼吸综合征病毒变异株RT-PCR检测方法的建立和应用.pdfVIP

国家星火培训计划及国家农业行业科技：第十届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 6l 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株RT-PCR 检测方法的建立与应用‘ 李彬，刘苏燕，高建峰，赵付伟， 方六荣，江云波，肖少波“ (华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，华中农业大学动物医学院，武／X-430070) 摘要2006年，我国暴发的“猪高热综合征”给我国养猪业带来了巨大的经济损失，经研究表明，其致 列特征，以发生缺失的Nsp2为靶基因，设计一对特异性引物，建立了能够同时检测PRRSV Nsp2缺失变 大量临床病料的检测，揭示华中地区目前流行的主要是PRRSV变异株，同时表明该方法简便、可靠，可 以鉴别高致病性PRRSV，为PRRSV的鉴别诊断、流行病学研究及其预防和控制提供了很好的工具。 关键词猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株；Nsp2；RT-PCR；鉴别诊断 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine and reproductive respiratory 病毒(Porcine reproductiveandrespiratory 发热、厌食、早产、流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍，新生及断奶前仔猪高死亡率以及各年龄段 尤其是仔猪的呼吸道疾病为特征。PRRS于1987年首次在美国南部发现并报道[1】，现已遍及世界各主要养 猪国家与地区，并已成为危害养猪业最严重的传染病之--[2]。该病在我国自1996年报道以来，已广泛存 在于全国各省，并呈流行趋势【3】。 睡、皮肤潮红、呼吸道症状明显和高死亡率为主要特征的高热综合征，简称“高热病”，给我国的养猪业 造成了巨大的经济损失。目前已证实，PRRSV Nsp2缺失变异株是引起该病的主要致病因子[4】。目前用于 变异株与非变异株，因此，建立针对PRRSV变异株的特异性诊断方法十分必要。 鉴于此，本研究根据PRRSV经典毒株和变异毒株的序列，设计出一对扩增Nsp2基因的特异性引物， 要意义。 1．材料与方法 I．I病料的来源 从华中地区采集PRRS疑似病例猪的血清、心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、淋巴结、扁桃体、关节液 62 国家星火培跏l计划及国家农业行业科技：第十届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 等病料，置．20℃保存备用。 1．2病毒 MLV由本实验室保存。 株RespPRRS 1．3引物设计 根据PRRSV经典毒株和变异毒株的序列，设计出一对扩增Nsp2基因的特异性引物，并设计了保守基 因ORF7的引物(表1)。 表1引物 引物序列 核苷酸序列 扩增长度 Nsp2F 5’．_1’(K赋GACAATGTCCCTf认C．3’ 508／418bp 5’-GCTGAGTNn广ITGGGCGTGTG-3’ Nsp2R oRF7F 5’．TAGGTGACTTAGAGGCACAGl：3’ oRF7R 5’．TAA觚ATGCCAAATAACAAC-3’ 450bp 1．4试剂 物工程公司；其他各类试剂均为进口分析纯试剂。 1．5病料的采集与处理 组织样品用剪刀剪碎后，研磨、匀浆，取上清．20C保存备用。 1．6总RNA的提取 取样品200ul血清或组织匀浆于1．5mlEP管中，按Trizol试剂盒提取RNA。 1．7 RT-PCR检测方法的建立 Nsp2 通过对不同稀释倍数病毒液的Nsp2 对PRRSV和其它不同种病毒进行RT-PCR检测验证其特异性。 2．结果 2．1 RT-PCR反应条件的确定 Nsp2