乳腺癌患者瘦素受体基因变异研析.pdfVIP

第五届华北地区三省两市检验医学学术会议论文汇编 - - ；iiij；；青；宣i暑暑暑暑i；i；ijiji暑宣i；ii；；；i；i；；；i；i；暑i；i暑iii；；iiiiii；；；i；iii i i,ii；iiii 乳腺癌患者瘦素受体基因变异分析 韩存芝1杜丽莉1田富国2武海明2赵先文1荆结线1 1山西省肿瘤研究所病因室太原(030013)2山西省肿瘤医院乳腺治疗中心 近年来来研究表明，肥胖是乳腺癌发生的一个重要独立危险因素，同时也影响乳腺癌的发展和 预后。研究发现与肥胖相关的瘦素基因和瘦素受体基因(OB．R)在乳腺癌发生、发展过程中起着 重要作用。本研究通过检测乳腺癌患者OB．R的基因位点变异及相关因素的变化，以探讨OB．R在 乳腺癌的发病机制中的作用。 材料与方法 一、临床资料： 1．选取山西省肿瘤医院乳腺治疗中心2005年1月至2007年1月行手术治疗的部分乳腺癌患 腺腺瘤及增生等)，年龄28～65岁，中位年龄46岁，术后均经组织病理学确诊。同时以年龄、地 区匹配健康人群抗凝血100例为对照，并对所有研究者进行健康问卷调查，测量身高、体重，计算 体重指数(BMI=Kg／m2)。病例和对照组均排除糖尿病及其他系统恶性肿瘤。 2．标本收集： 收集乳腺癌和乳腺良性病患者手术其间病灶新鲜组织标本O．5--一1．09，经生理盐水冲洗后置于 液氮罐中保存，1月之内采用酚、氯仿法提取DNA，健康对照抽取肘静脉抗凝血，采用高盐沉淀 法提取外周血白细胞基因组DNA后，．280C保存备用。 3．试剂：酚提取及银染检测相关试剂(北京化学试剂公司提供)，PCR扩增相关试剂(大连生 物工程有限公司提供)，聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂(BoehringerIngelheimBioproductsParterhip 5．0软件 公司产品)，甲叉双丙烯酰胺(Solarbio公司产品)。引物(参照相关文献由promerprimer 设计【6】，由北京三博远志生物科技有限公司合成。 4．仪器：PCR扩增仪GeneAmp9700型(美国PE．AppliedBiosystems公司产品)，核酸蛋白分 速离心机5415D型(Centrifuge公司产品)。 二、实验方法： 1．PCR体外基因扩增体系：OB．R四个外显子扩增的反应体系分别为：无菌三蒸水16．5pl， 10xPCRBuffer 1]广兀TGTAAGCAA]nf-3；第九外显子(exon9)为： ATAAGGAGGGTCCATAAT．3’。第二十外显子(exon20)为： DNATaq聚合酶O．3ul(总量1．5u)，DNA模板2．01d，震荡混匀，瞬间离心。 S， 2．PCR扩增条件：LEPRexon4扩增条件，预变性94℃5rain，变性94℃45S，退火55℃，45 ·365· ：塑：些璧塑!!!!：!：!!坚塑 30个循环，反应结束，4C储存备用。exon9扩增条件，预变性94C8ram．变性94C50s．退火55C60s． 4rain，变性94C 预变性94C 环．反应结束．即刻4U储存。 3对照设置PCR扩增时空白对照采用去离子水代替模板．其余操作与样本一样的扩增产物。 4 PCR扩增产物检测：PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳，电压为125V，时间约30分钟，溴化 乙锭染色．紫外灯下观察结果，用凝胶扫描仪进行扫描，用Kedar图像分析软件系统分析。采用 Marke作为分子量标定物．确定基因扩增片段范围。 5 DNA序，0分析：所有的PCR扩增产物经凝聚电泳证实、回收纯化后备取20／at送北京奥科 生物科技公司，在AT3】377铡序仪上进行序列分析，以判定基凼变异类型。 6统计分析：资料梭青无误后，输入SPSSll 5forwindows软件包，进行f及相关统计分析。