减毒沙门菌承载的质粒DNA在小鼠体内的组织代谢和免疫应答.pdfVIP

2009年增刊 学术研究 减毒沙门菌承载的质粒DNA在小鼠体内的组织代谢与免疫应答 方希修1， 乐国伟1， 王冬梅2， 施用辉1， 刘建文2 (1．江南大学食品学院食品营养与安全研究所、江南大学工业生物技术教育部重点试验室，无锡214036； 2．江苏牧医学院营养与饲料研究所，泰州，225300) 摘要：研究外jj募质粒pcDNA3s被减毒伤寒沙门菌承载后在小鼠体内的组织分布与代谢，研究重组减毒鼠伤寒沙门 菌的细胞免疫与体液免疫反应．将质粒pcDNA3s电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786，构建重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗， 分另9灌胃饲服昆明种小鼠．通过PCR方法检测质粒pcDNA3s经口服进入小鼠体内后在各组织中的分布及随时间变化的 情况；利用时问分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测小鼠的血清抗体含量，检测重组茵引起的T细胞增殖和细胞毒性T 淋巴细胞反应．口服后2周所有的组织均能检测到质粒，外源质粒在小鼠细胞内逐渐被清除；用流式细胞术检测贴壁培 首次免疫后第2．5、8、1l周分别测定血清中抗．HBs，口服免疫小鼠第ll周的抗HBs含量最高．重组减毒鼠伤寒沙门 菌是质粒的良好载体，是研究质粒代谢机制的有效途径，口服免疫途径均能在小鼠体内诱导细胞和体液免疫应答，可能 是极具前景的乙型肝炎的治疗方法。 关键词：外源质粒；减毒伤寒沙门菌；组织代谢；免疫应答 自从1990年WolfftlJ等首次报道肌肉注射裸入减毒伤寒沙门菌，Lj服接种小鼠，观察外源质 质粒DNA可被肌肉摄取并表达目的基凶所编码 粒pcDNA3s在鼠体内不同组织的分布及变化情 的蛋白质以来，DNA疫苗已经受到广泛的关注。 况，通过琼脂糖凝胶法分离质粒DNA与基因组 DNA疫苗可能给免疫预防治疗领域带来一场根本 DNA，发现在小鼠体内诱导细胞和体液免疫应答， 性的变革。但在其用于人体之前还有许多急需解 为重组减毒鼠伤寒沙门菌乙肝疫苗应用的安全性 决的问题，如疫苗的生产工艺、质量标准、制剂、 提供理论依据。 效用、安全性等问题。其中DNA疫苗的安全性是 1材料与方法 1．1质粒与菌株 首要问题12J。将质粒DNA注射入体内来达到基闪 治疗或免疫、代谢调控目的是九十代才开始的一 种新技术，显示出良好的应用前景。同时随着转 国科学院上海生物化学研究所馈赠；细胞增殖和 基冈作物、食品的增加，外源质粒DNA的肠胃道 细胞杀伤检测试剂为Promega产品；质粒 吸收、作用及其基闪转移对人类与动物健康可能 产生的影响，也引起了研究者的关注【26．¨。研究质 粒DNA疫苗的组织特异性分布和全身的分布情 况及与基因组DNA整合，是评估DNA疫苗安全 性的基础。DNA疫苗是将编码某种蛋白质抗原的 真核重组表达载体直接注射机体，在宿主细胞中 CurtissIII教授提供，江苏畜牧兽医职业 大学Roy 表达外源基闪，诱导特异性的体液免疫和细胞免 技术学院营养研究室保存。 疫应答，达到预防和治疗疾病的目的11|。接种重组 1．2试剂与试验动物 乙肝疫苗或合成肽疫苗均能增强乙肝患者的抗 HBV免疫应答，表明通过接种疫苗对机体施加 HBV抗原刺激有助于乙肝的治疗【2．引。 脂糖，低熔点琼脂糖：购白美国Sigma公司；抗 伤寒沙门菌是细胞内侵袭性致病菌，可通过 生素氨苄青霉素(加np)：齐鲁制药厂产品；一般化 肠道和上呼吸道途径感染，侵入粘膜相关淋巴组 学试剂采用国产分析纯试剂。乙肝HBsAg时间分 辨荧光免疫分析测定试剂盒购自上海新波技术开 织(MALT)，被MALT内的专职APC吞噬，在其 发有限公司，LDH细胞毒性检测试剂盒购白Roch 中增殖14J。本研究将携带HBsAg的DNA疫苗导