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第三章 临床免疫学检验 参考书：本次培训班教材，临床酶免疫测定技术（李金明编著，人民军医出版社） 教学方式：示教、操作、提问、讲解等。 总学时：90-100min 检验流程及相关重点知识 分析前 （一）酶免实验室需要的基本配置 酶标仪使用的注意事项 （1） 测定波长，根据标记用酶和底物选择相应的波长 （2）测定的吸光度范围，0~2.5之间基本能满足ELISA的测定要求，主要看在一定的吸光 度范围内的线性和精密度如何。 （3）光学系统，通常采用的是垂直光路多通道（8或12通道，亦有单通道）检测，除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道。光学系统功能可通过酶标仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等体现出来。其中测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系。 （4） 检测速度，检测速度快有利于提高检测的精密度。 （5） 震板功能 （6） 软件功能：定性试验的cutoff及其测定灰区的统计计算功能；定量试验的剂量反应曲线的拟合；以及实验室LIS系统数据传输等 2、洗板机使用的注意事项： （1） 最小残留量是衡量洗板机洗板效果最重要和最直观的参数 （2）洗板机最好具有底部冲洗、两点洗液等功能的仪器。底部冲洗有利于减小微孔板底部的干扰性吸附，两点吸液可大大降低微孔液体残留量。 （3） 每日使用完毕后应用1%次氯酸钠冲洗管路和洗板头，然后用双蒸水冲洗管路。 3、加样枪使用的注意事项 （1） 具体操作：设定容量值，吸液，放液 （2） 预洗：当装上一个新吸头或改变吸取的容量值时应预洗吸头，先吸入一次液样并将之排回原容器中，提高移液的精确度和重现性。 全自动酶免分析仪的简单介绍 （1）全自动酶免分析仪集加样，温育，洗板，比色于一体，使用注意事项1）做好标本的前处理2）准备好微孔反应板3）注意报警信息4）搞好日常维护与保养’)2片段作为固相或测定酶标抗体 (三)试剂的选择和准备 1、选择优质试剂，试剂质量在很大程度上决定了检测水平选择灵敏度高，特异性好，精密度（CV）好（批内CV 值小于15 %稳定性和安全性好，且简便经济的试剂不同批次的试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件，严格执行这一标准可以避免试剂批号改变而重建质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性从4冰箱取出的试剂必须放置室温20～30 min 后再启用水化层的形成可能影响试剂的原始浓度及试剂中溶质分子的均匀分布。未用完的试剂和质控品应密封并及时放回冰箱保存蛋白质在冷冻过程中出现蛋白分子分布改变，试剂正式启用前应充分混匀。所用蒸馏水、去离子水应为新鲜的和高质量的自行配制的缓冲液必须调整其pH 值和离子强度等。制备辣根过氧化物酶制备方法主要有两种，戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。2）过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体1~2：1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，?（3）酶结合物工作浓度的确定。 使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。 7、显色 （1） 显色是EL