牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用.pdfVIP

动物检疫学分会2010年年会论文集 牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-POR检测技术的建立 及初步应用 任艳1，陈创夫n，乔军1，王鹏雁1，盛金良1，王远志2，张沾1，李臻1 (1．石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；2．石河子大学医学院，新疆石河 子832003；) 摘要：以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的保守基因5’一非编码区为参考，设计、优化一对 特异的荧光定量PCR引物，应用SmartEyelell分析系统，结合EvaGreen荧光染料结合原 理，建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为 10-106copies／u 倍。该方法具有良好的特异性，检测变异系数低于1％．应用本实验建立的方法检测25份不 同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品，阳性检出率为72％(i8／25)，与病毒分 离培养和电检观察相比，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点，为 实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。 关键词：牛病毒性腹泻病毒：实时定量RT—PCR；建立 牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrhea 瘟病毒属(Pestivirus)，感染家畜后引起腹泻、流产、呼吸道疾病和免疫机能障碍，并且 是二次病毒感染和细菌感染的诱因n1。目前该病已在世界范围内广泛传播，给养牛业国家造 成了巨大的经济损失。我国BVDV多以非特征性临床症状呈现，大多是隐性感染。目前已知BVDV 有15个不同的基因型，各个基因型在抗原性方面存在差异幢1，这些特点都给该病的诊断和检 测带来了很大困难。目前，检钡UBVDV常用方法主要有血清中和试验、免疫荧光试验(IFA)、 酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒分离和电镜检查等，这些方法或者耗时费力，不利于快速 诊断，或者灵敏性、特异性较差，无法准确检测口3。因此，建立新的检测BVDV技术对于该病 防治具有重要的意义。荧光定量PCR技术以其快速检测、灵敏度高、特异性好的优点已被广 泛应用于许多疫病的诊断和检测中H3。BVDV5’一非编码区(UTR)基因在瘟病毒属基因组中 相对保守，根据5’—￡髓因设计的引物可扩增出BVDV不同地域分离株的序列晦1。本文依据 57—￡仍基因设计特异性引物，建立了BVDV的荧光定量PCR检测方法，为该病的诊断和防控 奠定了基础。 1材料和方法 BVDV 1．1毒株和细胞 OregonC24V株、MDBK细胞、BVDV标准阴性血清均购自中监所；叵 幻1iDH5 Q为本室保存；牛粪样品采自新疆不同地区临床症状疑似BvDv感染的病牛。 基金项目：国际科技合作项目(2006DFA33740)资助 作者简介：任艳(1980-)，女，河南郸城县人，博士生，主要从事免疫机理与抗病育种研究，E-mail： ryebl225@163．c,OIll ·通讯作者：陈创夫，教授，博士，主要从事免疫遗传与抗病机理研究，Tel：0993．2058002，E-mail： 63．corn eef-xb@1 184 动物检疫学分会2010年年会论文集 1．2细胞培养基、工具酶和主要试剂 Reagent购自美国Invitrogen公司；ImProm-II。。ReverseTranscriptionSystem试剂盒购自 美国Promega公司：多功能DNA纯化回收试剂盒，购自北京百泰克生物技术有限公司：DNA Mini DNA Marker，TIANprepPlasmid试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；Taqplus polymerase，T4 超滤浓缩管购自PallCorporation(美国颇尔公司)；引物合成和测序由上海生工生物工程技 术服务有限公司完成。 1．3引物设计 根据NCBI网站公布的多个BVDV5’叫孺基因序列，经DNAMAN软件多重序 列比较，使用Oli906．0软件设计一对荧光定量PCR引物，Pl： 为235bp，并在NCBI上对引物进行特异性比对。