DGGE技术在肠道微生物研究中应用.pdfVIP

技术篇 DGG E技术在肠道微生物研究中的应用 刘诚刚白秀娟 (东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨。150030) 摘要：变性梯度凝胶电泳(DGGE)做为一种分子指纹技术，近年来已经广泛应用于肠道微生物研究的领域 中，它具有可靠性高、重复性强、方便快捷等优点．本文主要概述了DGGE技术的基本原理、操作流程以及近年来 在肠道微生物领域的一些应用． 关键词：变性梯度凝胶电泳；肠道微生物 到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱 1 DGGE的发展 基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以 eatu radient 变性梯度凝胶电泳(d ringg gel 检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及 少于10个碱基的缺失突变。 electrophoresis．DGGE)作为一种检测DNA突变的技术最早 由Fischer和Lerman于1979年提出。它的分辨精度比琼脂糖为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个 高熔点区川c夹。GC夹(GC 凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高，可以检测到一个核 clamp)就是在一侧引物 苷酸水平的差异。Myers等(1985)首次在DGGEq=使用“GC 物的一侧可产生一个高熔点区，使相对应的序列处于低熔 夹板”技术．使该技术走向成熟。Muzyer等(1993)首次 将DGGE技术应用于微生物菌群研究领域，并且证实了 点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接 DGGE技术在揭示种群差异和自然界微生物区系遗传多样 近于10006。 性方面具有独特的优越性。最近几年DGGE己经广泛应用 3DGGE的技术流程 于各种环境的微生态研究，如环境监测、土壤、河流、根 茎、反刍动物和非反刍动物的肠道微生物等。 3．1样品的采集 2 DGGE的基本原理 要求无菌操作，采取后立即试验，如果不能及时实验 则放入一80。C保存，如果采取的是单胃动物，则在不同肠 变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种根据DNA片段的 熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一 段部位分别采取。 定条件下可以解链，称之为变性。核酸50％发生变性时的 3．2样品中微生物总DNA提取 温度称为熔解温度(Tm)。Tm值主要取决于DNA分子中 GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温 可用机械法、化学法或试剂盒提取，前期处理保持无 度50-60℃。变性剂(由尿素和甲酰胺组成)0,一100％。菌操作。 当一条双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的 3．3 16SrRNA可变区PcR扩增条件优化 凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段 DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解．而高熔点区 通过对扩增条件的摸索。可以使扩增产物更纯．对后 仍为双键。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达 续试验的结果更有利。