精减9分子生物学技术简介-08硕.pptVIP

第九章 分子生物学技术简介 核酸纯化技术与电泳技术 PCR技术 分子杂交与印迹技术 基因靶向技术 一、核酸纯化技术DNA纯化 1. 核酸混合物成分: 结构类-细胞碎片，细胞器，其他 大分子-DNA，RNA，Protein，糖类，脂类等 小分子-氨基酸，小分子糖类和脂类，水，无机物等 2. 关键: DNA，RNA—Protein 3. 方案： Protein变性 苯酚：强变性 25 氯仿：弱变性 24 异戊醇：消泡 1 一、核酸纯化技术DNA纯化 4. 苯酚的处理：重蒸-饱和-pH 重蒸：去除醌类氧化物 饱和：防止核酸损耗 pH： pH7.0-8.0-核酸最适合 方法：蒸馏（183℃）-收集（棕色瓶）-饱和与调pH（Tris-HCl pH8.0）-0.1% 8-羟基喹啉- 4 ℃或-20 ℃保存 方法 样品+等体积饱和苯酚 10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡 离心（12000*g） 取上清 核酸相 Protein变性相 有机相 电泳影响因素 1. DNA物理性质 质粒： CC＞L ＞OC 线形：长度与泳动速度成负相关 2. 介质性质 分离范围：agrose：100bp-60kb PAGE：5-500bp 3. 电压：5v/cm 4. 缓冲液：TAE，TBE，TPE 核酸定量的原理 核酸的紫外吸收 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm的紫外波段有一强烈吸收峰，最大吸收值在260nm附近。 纯核酸能用此法定量测定含量，但不纯样品不能用此法作定量检测。 琼脂糖凝胶电泳分离出区带，用EB染色后在紫外灯下粗略估计含量。 核酸定量的原理 双螺旋DNA：1OD260=50ug/ml 单链DNA/RNA：1OD260=40ug/ml oligonucleotide ：1OD260= 20 ?g/ml 纯度：OD260/OD280=1.8-2.0 小于1.8，表明有蛋白质污染 大于2.0，表明有RNA污染。 核酸纯化技术与电泳技术 PCR技术 分子杂交与印迹技术 基因靶向技术 二、PCR技术 PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。 理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。 PCR技术与Nobel Prize Polymerase Chain Reactiona copying machine for DNA molecules DNA molecules can be mass-produced from incredibly small amounts of material with PCR. Mullis discovery allows the chemist to mimic the cells own natural DNA replication process in a test tube. It has now become much easier to characterise and compare the genetic material from different individuals and organisms. PCR反应系统的组成 PCR反应系统应包括： 1．耐热DNA聚合酶（Taq酶）：这是由耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可保证在95℃，30分钟以上不会变性失活。 2．模板DNA(template)：即待分析的目的DNA。 3．两种引物(primers)：为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板DNA链的3’-端。 4．四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)：用作底物的dNTPS。 5．缓冲溶液（buffer）：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值。 PCR的反应原理 PCR反应时，一般采用变性-复性-延伸三步循环，也可采用变性-延伸两步循环。 1．变性：通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到950C，使双螺旋DNA解开成为单链。 2．复性：通过降低反应温度至550C，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3`端粘合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3`-OH。 3．延伸：将反应温度提高到约700C，在耐热DNA聚合酶的催化下，根据模板DNA提供的碱基顺序，合成两条互补链，从而使模板DNA扩增一倍。 按照上述步骤重复操作约30次，即可将模板DNA扩增数百万倍。 PCR的主要用途 （一）目的基因的