双向凝胶电泳实验方法.docVIP

实验方案 样品制备（Sample preparation） 1.1仪器 高速离心机 1.2试剂 NS（制备好的）；Citrated human plasma ；溶解缓冲液(9M 尿素，4 ％ CHAPS，2 ％ IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法 .吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37℃下孵化5min。NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。 孵化后，将样品高速离心，离心转速为 ，时间为。。。。。 除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。 4）将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 ％ CHAPS，2 ％ IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。 2.第一相等电聚焦（IEF） 2.1固定化 pH 剃度胶条的水化（IPG strip rehydration） 2.1.1仪器 IPGphor 2.1.2试剂 水化液（8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液） 水化液需当天新鲜配制 2.1.3实验步骤 A. 加样品溶涨 1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 ％ CHAPS，2 ％ IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品 。蛋白质上样浓度（Q:如何确定上样浓度？）不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。 2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。 表1 IPG胶条所需水化液体积 3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。 4).IPG 胶条上覆盖适量矿物油，盖上盖子。 5).将标准型胶条槽的尖端背面电极与 IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。 6).设置 IPGphor 仪器运行参数：IPG 胶条溶胀的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见表 2。 低电压时水化，有利于高分子量蛋白质进入胶中，并减少蛋白质形成积聚集体。 表2 IPGphor电泳参数 7).IPG 胶条水化溶胀后可自动进行等电聚焦电泳。 8).暂时不进行第二向的 IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80℃保存几个月。 B.不加样品 IPG 水化溶胀 a. 标准型胶条槽： 1).用适量的水化溶胀液进行胶条溶胀，3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。4).IPG 胶条上覆盖适量矿物油，盖上盖子。5).将标准型胶条槽的尖端背面电极与 IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器的阴极平台接触，溶胀过夜。 2).于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。每个加样孔的一侧可加入7.5μl样品(每个加样孔分别有两侧可加样)，采用此种方法上样，每个胶条槽最多可加入30μl样品。 3).设置 IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度，电泳参数见表2。 4).进行等电聚焦电泳。 5).暂时不进行第二向的 IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80℃保存几个月。 2.2第一向胶条的平衡（IPG strip equilibration） IPG 胶条平衡两次，每次 15 分钟。平衡缓冲液包括 6 M 尿素和 30% 甘油， 会减少电内渗，有利于蛋白质从第一向到第二向的转移。第二次平衡步骤中加入 260 mM 碘乙酰胺，以去除多余的 DTT (银染过程中，DTT 会导致点拖尾 point streaking)。 IPG 胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向 SDS 胶中。 2.2.1仪器： 玻璃管 (200 mm 长, 20 mm i.d.), Parafilm, 振荡仪 2.2.2试剂： 1).分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl, pH 8.8 和 0.4 %（w/v）SDS） 2).平衡缓冲液(0.05 M Tris-HCl , pH 8.8，6 M 尿素, 30 % (w/v) 甘油和 2 %(w/v) SDS) 3).溴酚蓝溶液: 0.25 % (w/v) 溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中 2.2.3实验步骤