噬菌蛭弧菌分离与纯化.docVIP

噬菌蛭弧菌分离与纯化 1.采样：虾池水 底泥 虾池周围排水沟水 底泥 2.培养基：自来水或天然陈海水琼脂，双层琼脂平板 下层为1.0% 上层为0.5%琼脂。 宿主菌培养基：胰蛋白胨10g/L 酵母膏5g/L NaC1 10g/L PH=7.0-7.2 浸出液：1/10YP浸出液即 酵母膏0.03g/L 蛋白胨0.006g/L 用于将蛭弧菌从平板中浸出。 3.宿主菌及菌悬液制备 用于分离培养计数蛭弧菌宿主菌六株：副溶血弧菌 鳗弧菌 溶藻弧菌 嗜水气单胞菌 施氏假单胞菌 大肠杆菌 宿主菌菌悬液制备：（通常培养基中宿主菌的浓度采用108 -109 cfu/mL ） 斜面活化 2ml无菌水洗菌苔 4×4.5-5.0L/10L 4000 r/min离心 30-37℃ → 4×100ml/500ml三角瓶 → 30-37℃ 18-20h → 30 min，去上清液 18-20h 180-200 r/min 180-200 r/min 无菌自来水洗涤一次 30-37℃ 18-20h 离心一次，去上清液 加无菌水定浓或 100-105℃灭活10min 后集中沉降 24h去上 清液 洗一次弃上清 液，加入无菌水或生 理盐水调至 1012cfu/m L添加量 0.2%或调至 3× 1010cfu/mL ，添加量 15-20% 4.富集培养 100ml水样/250ml 5 ml宿主菌液 菌浓度达108 Cfu/m1 → 富集菌悬液 八层纱布扎口 PH7.0-7.6 25-28℃ 24-48h 注：虾池水 排水沟水富集培养后菌斑数量高于直接培养，池底泥反而减 少。 5.分离纯化 双层琼脂分离法：将1.0-1.5%琼脂注入无菌平皿（10 ml左右），静置2-3h，分别注入0.5ml不同的梯度稀释菌液，然后将溶解后（0.5%琼脂）分装试管（5ml/只）置于45-50℃水浴锅中，加入0.2ml浓宿主菌（蛭弧菌的计数：0.5ml蛭弧菌液和0.2ml宿主菌，宿主菌浓菌液浓度1012cfu/mL），充分混均，趁热注入下层培养基上，均匀，25-30℃，倒置5-7天，连续观察。 双层琼脂平板法培养蛭弧菌，24h有菌斑出现，一般48-72h出斑率高，直到5-7d，出现几种不同类型的斑，多数呈圆形，菌斑清晰，边缘整齐透明，菌斑大小随时间延长而增大并相互融合变得模糊。热死菌悬液出斑时间短（48h出斑），菌斑清晰。在热死宿主菌生长蛭弧菌，再接种于活的宿主菌琼脂平板仍能恢复其生长特性和裂解活力。 菌斑纯化：用直径1-2mm吸管吸取或将菌斑挖出不同类形单菌斑置于1-2 ml，灭菌自来水或海水（1/10YP或1/500NB）中28℃浸泡30min,然后用浸出液作双琼脂平板或梯度稀释作平板28℃ 2-3天形成二代菌斑，三代菌斑，出现菌斑形态均匀一致，取多个纯化噬菌斑置于4.0-6.0℃条件下保存。 液体增殖试验： 95ml无菌水/250ml 蛭弧菌液 5ml蛭弧菌浸出液 → 25-28℃110 r/min 0.2ml宿主浓菌液 5-7天 PH7.0-7.6均匀 3-5天菌悬液转清 八层纱布扎口 经验数据：宿主菌液添加1/500即0.2% （对培养基）蛭弧菌最佳生长条件：宿主菌浓度1010 cfu/mL。 NaC1 3.0% PH7.0-7.2 25-30℃ 110 r/min 象其它细菌一样需要适量的NaC1保持渗透压外，还需要一定钙镁离子，当使用自来水 培养基时水中含阳离子的浓度基本保证蛭弧菌的需要， 海水种应考虑盐类作用。 天然海水作培养基比人工配制蛭弧菌的检出率高10倍，天然海水中存在不明促进因子。 6.蛭弧菌培养物保存方法 6.1灭菌自来水软琼脂保存法： 6.1.1培养基：琼脂4-5g/L 自来水1L PH7.4-7.6 加热溶解后分装试管，121℃ 20-30 min灭菌备用。 6.1.2菌悬液的制备： 宿主大肠埃希氏菌C600菌悬液的制备克氏瓶或茄型瓶斜面培养 30-37℃ 18-24h 用蒸馏水或自来水洗涤并结合接种环刮下菌苔，经离心沉淀制成3-4×109