实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定.pptVIP

蛋白质的两性反应（1） 蛋白质的两性反应（2） 蛋白质的两性反应（3） 蛋白质的两性反应(1) 蛋白质的两性反应(2) 蛋白质的两性反应(3) 酪蛋白等电点的测定 什么是蛋白质的等电点？ 在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？ 实验项目 实验原理 试剂和器材 操作方法（主要步骤） 结果分析 思考题 实验三 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾 生物化学与分子生物学实验 实 验 二蛋白质的两性反应与等电点测定 了解蛋白质的两性解离性质 掌握测定蛋白质等电点的方法 实验目的 P COOH NH2 P COO- NH3+ P COO- NH2 P COOH NH3+ pH=pI +OH- pHpI +H+ +OH- +H+ pHpI 兼性离子 阳离子 阴离子 实验原理 在等电点时蛋白质颗粒上的净电荷为零，缺乏同电相斥的因素，蛋白质溶解度最小，最容易析出沉淀 维持蛋白质胶体稳定的因素： 表面电荷、水化膜 本实验配制了各种不同pH值的缓冲液，沉淀出现最多的缓冲液pH值即为酪蛋白的等电点 实验器材与试剂 大试管、滴管、刻度吸量管 0.5％酪蛋白醋酸钠溶液 0.01％溴甲酚绿指示剂(指示范围: pH3.8-5.4) 0.02M HCL溶液、 0.02M NaOH溶液 0.01M醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、 1.00M醋酸溶液 实验步骤 取一干净试管 酪蛋白液10滴 溴甲酚绿指示剂3滴 观察溶液颜色 并解释现象 滴加0.02M HCL溶液 边滴加边混匀 有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化 至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象 继续滴加0.02M HCL溶液 边滴加边混匀 继续滴加0.02M NaOH溶液 边滴加边混匀 有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化 至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象 继续滴加0.02M NaOH溶液 边滴加边混匀 溶液呈蓝色 实验结果 酪蛋白溶液呈碱性 (pH﹥5.4)，使溴甲酚绿指示剂显蓝色 [H+] ，沉淀 出现最大量沉淀时,说明到达了酪蛋白的等电点 溶液由蓝色变成浅绿色（3.8﹤pH﹤5.4） 继续加酸，[H+]继续增大，pH＜pI。酪蛋白所带正电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶液显黄色(pH﹤3.8) [OH-] ，沉淀 出现最大量沉淀时,说明到达了酪蛋白的等电点 溶液由黄色变成浅绿色（3.8﹤pH﹤5.4） 继续加碱，[OH-]继续增大，pH﹥pI。酪蛋白所带负电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶液显蓝色(pH﹥5.4) 结论 1： 酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4之间 pH= pI时，蛋白质溶解度最小 蛋白质是两性电解质 取7支同样规格的干燥试管，精确加入各试剂 5.9 5.6 5.3 4.7 4.1 3.8 3.5 pH 0.62 1.25 2.5 — — — — 0.01M醋酸 — — — 1.0 4.0 — — 0.1M醋酸 — — — — — 0.8 1.6 1.00M醋酸 3.38 2.75 1.5 3.0 — 3.2 2.4 蒸馏水 7 6 5 4 3 2 1 试管号码 酪蛋白等电点的测定 注：单位均为mL 向每个试管中各加0.5%酪蛋白溶液20滴， 加一管，立即混匀一管 静置30分钟后，以0、+、++、+++、++++表示各管的混浊度，并指出哪一种pH是酪蛋白的等电点 0 0 ++ ++++ +++ + 0 沉淀量 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 实验结果 结论 2： 4号试管沉淀量最多 说明4号管溶液的pH值为酪蛋白的等电点，即pI=4.7 思考题