中国东南沿海青蟹属不同种类的mtDNA+COI基因序列分析及其系统发育.pdfVIP

第二十一节 中国东南沿海青蟹属不同种类的mtDNA COI基因序列分析及其系统发育 青蟹属(Scylla)是由deHaan于1833年建立的，并将锯缘黄道蟹更名为锯缘青蟹 ScyUa 酶和mtDNA的COI序列分析，结合形态、生态学特征，确认从东非到印度一西太平洋分布 着4种青蟹，即锯缘青蟹，紫螯青蟹s S 段序列尚未见报道。 本研究通过分析我国4种青蟹mtDNACOI片段序列，以阐明其遗传差异和系统进化 关系，并从分子生物学角度进一步验证我国青蟹属的种类组成。 一、材料与方法 (一)材料 野生青蟹个体。参照Keenan[121对青蟹属的分类方法对样品鉴定分类‘161。 (二)方法 1．基因组DNA提取 取100 mL mg足部肌肉，放入1．5 mmol mmol tool (100 Tris—HCI，200EDTA，1．4NaCI，2％十六烷基三甲基溴化铵 ms／mL)蛋白酶K，55。C水浴过 (CTAB)，0．2％(WV)B一巯基乙醇，pH8．0，)和8p,L(20 2 加入一20。C预冷的异丙醇，一20。Ch。离心后用70％和100％乙醇各洗1次，加入 分光光度计测DNA含量。 2．PCR扩增 引物由英骏生物技术有限公司合成，2个引物分别为：COIa E CCGAGTC，COIlcCTGcAGGAGGAGGAGAYcc 25 10×buffer，0．2dNTPs，2 pL反应体系中含有2．5斗L txmol 0ngDNA，引物(5斗moL／L) s，运 1恤L及1U勋酶。经94℃变性5rain后；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸60 行35个循环；最后在72。C延伸10min。扩增产物用2．0％琼脂糖凝胶电泳分离，EB染 色，凝胶成像系统观察、记录。 189 3．测序及数据分析 PCR扩增产物由英骏生物技术有限公司进行测序。将测序结果提交GenBank。已知 构建系统树，各分支的置信度均进行l000次的重复检验。 二、结果 (--)4种青蟹COI基因序列及其差异 537 633 4种青蟹COI序列长度分别为：S．olivavea bp，S．se，7优口 bp，S．paramamosain 626 539 bp，＆tranquebaricabp。其A、G、T、C含量见表1。 表1 4种青蟹mtI)NAC01片段的A、G、T、C含量 种类 A G T C AT GC 4种青蟹mtDNACOI部分序列排序见图1。仅有锯缘青蟹有1个缺失的位点，4种青 蟹序列间共有129个变异位点，定义了129个核苷酸替代。其中转换97个，颠换32个。 3，碱基相差在55 各种内的遗传距离和种问遗传距离见表2。种间遗传距离平均为0．141 个以上。种内遗传距离平均为0．0062，碱基相差在5个以内。种间的碱基变异有32个 为A／T，G／C颠换，种内的为A／G，T／C转换。 表2中国青蟹属4种与GenBank中相应种的遗传距离(下三角)遗传相似性(上三角) 种类