电泳方法实例.docVIP

?血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳及其定量 一、目的 1 ．了解电泳分离蛋白质的基本原理。 2 ．掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的方法。 二、实验原理 ????带电粒子在电场中向与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。电泳技术被广泛用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定，电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的粘度等有关。其中粒子荷电量又受周围介质的pH和离子强度的影响；电场强度则取决于电泳时所加的电压。根据支持物的种类及操作方式的不同，可将电泳分为许多种类，如滤纸电泳，醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳，淀粉颗粒或聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 ????本实验采用醋酸纤维薄膜为固相支持物。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿。氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干糙后就成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，制成厚度约为120?m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。 ????血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH值7.3。它们在pH值8.6的缓冲液中均解离带负电荷，电泳移向正极。由于血清中各种蛋白质的分子大小、形状及所带电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为：清蛋白及?1球蛋白、?2球蛋白、?球蛋白、?球蛋白等5条区带。薄膜置于染色液中使蛋白质固定并染色后，不仅可看到清晰的色带，并可将色带染料分别溶于碱溶液中进行定量测定，从而可计算出血清中各种蛋白质的百分含量。肝硬化时清蛋白显著降低，?球蛋白升高2～3倍；肾病综合症时清蛋白降低，?2和 ?球蛋白升高。 几种血清蛋白质的等电点、平均相对分子量、电泳区带及正常含量 三．实验材料 1．器材 电泳仪：0～500V，0～100mA，电泳槽（×1）； 醋酸纤维素薄膜（1.5～2×8cm，×2）； 小试管（×1），培养皿（×3），载玻片（×1），玻璃管平衡桥，玻璃片（4×10cm，×1）； 剪刀（×1）,平头镊子（×2），电吹风（×1）； 721或722型分光光度计。 2．试剂 （1） 巴比妥缓冲液（pH值为8.6，离子强度0.06）：巴比妥钠（C.P.）12.7g，巴比妥（C.P.）1.66g，置于盛有约200mL蒸馏水的烧杯中稍加热溶解，待冷到室温，用蒸馏水稀释到1L。 （2） 染色液：氨基黑10B 0.5g，加甲醇（C.P.）50mL，冰醋酸10mL，加蒸馏水到100mL，溶后备用。 （3） 漂洗液：16.50mol/L乙醇（医用）45mL，冰醋酸（C.P.）5mL ，加蒸馏水到100mL，混匀。 （4） 洗脱液：0.4mol/LNaOH溶液 （5） 透明液：冰醋酸（C.P.）25mL，加16.50mol/L(95%)乙醇（医用）75mL，混匀。 （6） 新鲜血清（无溶血 四．实验操作 1． 薄膜准备 ?????将醋酸纤维素薄膜切成8×2 cm条状（根据需要决定薄膜大小），在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一条横线（点样线），末端旁用铅笔作一标记。浸入巴比妥缓冲液中至完全浸泡均匀（浸泡所需时间随出厂质量而异，一般需浸泡20min或更长时间）。用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸之间，轻轻按压，吸去多余的液体。 2． 点样 把薄膜放在干糙的滤纸上。 ?????用较尖的血色素吸管或其它点样管吸取样品2～3?L（血清、纯化的清蛋白或?-球蛋白液等样品，若该样品液年度较稀时，要适当增加用量），涂在玻片的一端截面上（玻璃宽度应小于薄膜宽度），或用载玻片一端的截面在盛有样品的平皿内直接沾上2～3?L样品，然后将沾有样品的玻片截面于醋酸纤维素薄膜点样线轻轻地接触，平即呈一条线“印”在薄膜上，使样品尽量点得细窄而均匀，如图1（醋酸纤维素薄膜规格及点样位置）。点样量不宜太多，也不宜太少，这步是电泳的关键步骤。 3． 电泳 ?????已点好样品的薄膜架在铺有滤纸盐桥的电泳槽上，使薄膜粗面向下，点样端置阴极，膜应轻轻拉平，如图2（电泳槽剖面图）。 电泳槽加盖密封，以使蒸汽饱和，避免水分蒸发。平衡约5min，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。检查电泳装置线路是否正确，然后通电。调节电流强度为0.4~0.6mA/cm膜宽（有数条膜，便求数条膜宽的总和），或调节电压为10/cm膜长（薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和），数条并列的薄膜只要其中之一条即可。当蛋白（仔细观察可见淡黄色）移动约5cm即可切断电源停止电泳，一般通电40～60min。 4． 染色和漂洗 ?????电泳结束，取下薄膜，立即浸入染色液中5min。取出，尽量沥尽染色液，移入漂洗液中漂洗脱色，每隔5min换一次漂洗液，直至薄膜底色洗净为止（一般更换2～3次），用滤纸吸干