琼胶酶制备工艺.docVIP

琼胶酶的生产工艺 班级：09生工1班 学号：48 姓名：纪伟 前言 琼胶是一种从江蓠、石花菜等红藻中提取出来的水溶性多糖，主要由琼胶糖和硫琼胶两部分组成，琼胶糖是由1,3 连接的β-D-半乳吡喃糖和1,4 连接的3,6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的链状中性糖。硫琼胶结构较复杂，含有D-半乳糖、3,6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和硫酸基，丙酮酸[1]。琼胶酶能降解琼胶多糖，生成琼胶低聚糖，这些降解产物在食品领域均有良好的应用前景。而且，琼胶酶在PCR 产物回收等方面也极具应用价值。近年来随着糖生物研究及低聚糖制备技术的不断发展，低聚糖的巨大潜力受到越来越多的关注，及功能性食品、新化工品等研究的热点。虽然琼胶低聚糖的研究还远落后于肝素等糖类，但韩国、日本已对琼胶酶及其水解产物的生物活性功能已有一定的研究，证明了一定聚合度的琼胶低聚糖具有重要的应用价值和开发前景[6]。由此看来，开展琼胶酶的研究具有一定的科学意义和社会效益。在本实验中介绍从海水中分离到一株高产琼胶酶-短杆菌（Brevibacterium sp）的海洋革兰氏阳性菌的植被流程。 1 材料与方法 1.1 培养基及试剂 2216E 海洋细菌培养基 基础培养基（g/L ）：NaCl 25 ，NH4Cl 10 ，MgSO4.7H2O 5，KCL 10，FeSO4.7H2O 0.02， CaCl2 0.2，NaH2PO4 0.6，琼脂 1，pH 7.0；DNS 试剂:见文献[4]；0.2M 磷酸缓冲液 1.2 取样及处理方法 用无菌容器取海水，再用无菌海 水稀释后涂布平板，27℃恒温培养。 1.3 初筛和复筛 平板培养48h 后，取出观察，含琼胶酶的菌株的菌落周围会出现明显的凹陷。选取凹陷明显的菌株，2216E 海水琼脂平板划线分离纯化。初筛分离纯化得到的菌株，平板培养48h 后用卢戈氏碘液染色观察。琼胶平板可以被降解，能够产生琼胶酶的细菌，由于菌落周围琼胶被降解,降解后的琼胶不能着色，因此其菌落周围会产生水解圈(透明圈)。 1.4 菌种保藏 液氮保藏法 1.5 粗酶液的制备 取纯化的菌种接入琼胶培养基于22℃摇床培养16h，所得的培养液经4℃、5000r/min离心30min，收集上清液作为粗酶液用于酶活的测定。 1.6 酶活测定 在粗酶液中加入磷酸缓冲液（pH 值7.2,体积为所用液体培养基体体积的50％），然后取1ml，加入0.8％的琼胶糖溶液1ml，55℃酶解30min 后于沸水浴中灭活，加入DNS 试剂，在沸水浴中保温7min 显色。显色后的溶液经20℃、2000r/min 离心5min，取上清液稀释用紫外可见光光度计于540nm 处测OD 值，以煮沸灭活酶液为对照。以每分钟吸光度增加0.001 为一个酶活（U）。 2 酶的分离纯化 2.1 硫酸铵盐析 发酵上清液中加入硫酸铵粉末至0% ～ 90% 饱和度，4℃静置过夜，6000 r /min 冷冻离心30 min 收集沉淀，用少量冷却的磷酸盐缓冲液溶解，置于透析袋中透析除盐。测定不同区间透析液的酶活力和蛋白质含量，计算酶的比活力，由此确定此琼胶酶分段盐析适宜的硫酸铵的饱和度。 2.2 DEAE 阴离子交换层析 透析后所得酶液上样于DEAE 阴离子交换柱，用0 ～ 0． 8 mol /L NaCl 梯度洗脱，流速约为0． 5 mL /min，检测波长为280nm，洗脱液分部收集( 4． 5 mL /管) 。 测定洗脱管峰部分的试管中溶液的酶活力，将有活性的部分合并。 2.3 葡聚糖凝胶G-100 凝胶过滤层析 将2.2得到的酶液上样于20mmol /L( pH7． 2)Tris-HCl 平衡的葡聚糖凝胶G-100 凝胶柱并洗脱，控制流速为0． 5 mL /min。洗脱液经紫外检测并分部收集( 4． 5 mL /管) ，分别测定出峰部分试管的酶活力，将有活性的部分合并。3 讨论海洋微生物生产琼胶酶已有报道，1902 年Groleau首次从海水中分离到能分解琼胶的细菌－琼胶假单胞菌。从那以后，人们已经从海水系统中分离到了多种琼胶分解菌[1]，包括Pseudomonas(假单胞菌属)、Pseudoalteromonsa(假别单胞菌属)、Streptomyces(链霉菌属)、Alteromonas(别单胞菌属)、Microscilla、Vibrio(弧菌属)、Cytophaga(噬细胞菌属)等[8]。它们均是革兰氏阴性菌，而海洋革兰氏阳性菌生产该酶的报道似乎仍尚未见。不同的菌产生的琼胶酶特性不同，而革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌所产的酶在底物专一性、酶解产物等方面可能有更大的差异[9]。因此，研究革兰氏阳性细菌的琼胶酶的性质及底物特异性等，对于获得不同