荧光定量操作.docVIP

样品取回后，冻于-70冰箱中。样品包括组织样和血清样品。检查目的基因的表达情况。需要作的工作如下： 首先是组织总RNA的提取。提取步骤见TRNZOL试剂说明书。 组织mRNA提取后进行反转录，得到cDNA样品。 以CDNA样品为模板进行特定基因的扩增（可先用普通PCR验证/为了验证表达的差异，应采用定量PCR，并选用内参基因） 注意：为了让提取的RNA 质量可靠，每次研磨的组织样品不能过多，这就要求我们在取样是不能取太多的样品，而且所取样品必须准确、可靠。否则会导致后续试验都不准确。 总RNA 提取准备工作：、 （一）基本器材和试剂 1． 实验器具与材料 （1） 移液枪：1ml、200ul、10ul （2） 枪头：1ml、200ul、20ul （3） 枪头盒：1ml一个,200ul和20ul的枪头盒至少一个 （4） EP管1.5ml、100ul （5） 研钵:据一次提取RNA样品多少定. （6） 容量瓶：1000ml （7） 盐水瓶：100ml （8） 广口瓶几个（配75％乙醇，盛放氯仿，异丙醇等用） 2． 实验器具的处理与准备 （1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于0.1%DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜,然后送至高压锅灭菌(121-126 ℃)至少30分钟，后在60-70℃烘烤箱中烘干，试验前将枪头放入枪盒。 优级耗材可直接使用。 （2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在0.1%DEPC水中泡8小时左右(过夜)，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤(100-200℃)3次。 （3） 金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水） 3． 试剂配制和准备 （1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。 DEPC处理水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压去除未反应的DEPC。 （2） 75％乙醇（最好在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3),然后放于-4℃预冷备用。 （3） 异丙醇：放入棕色瓶 。 （4） 氯仿：放入棕色瓶 。 （5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃。 4. 抽提RNA工作台面准备 1.在仅用于RNA抽提的超净工作台抽提RNA 2. 工作台面用用RNAase失活剂处理。 （二）总RNA提取步骤： 1. 采样 样品采集需均一，迅速，组织样品避免血液污染，样品采集后迅速置于液氮或是-70℃. 2.样品的研磨: 先用少许液氮将研钵冷却,然后取少许组织样放于盛有液氮的研钵内迅速研磨成细粉末，取约少100mg样品于预先加入1mlTrnzol 的EP管中,用力颠倒混匀，室温静置5分钟,充分裂解细胞。 3.加入氯仿 向每管中加0.2ml氯仿。盖紧管盖，用漩涡振荡仪振荡15s（也可用手用力振荡1分钟左右），使其充分混匀，静置2-5min。 4.离心分离 4 ℃下12000g离心15分钟, 样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 主要在水相中，把水相（约500 μl）转移到新管中，注意不要吸取到蛋白层。 5. 转移上清 将含有RNA的上层清液转移到新的1.5mlEP管中后（约500ul),再加入0.5ml异丙醇,轻轻混匀后静置10分钟 6．RNA沉淀 然后4℃ 12000g离心10分钟,弃上清。离心前RNA 沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成白色胶状沉淀。 7.RNA洗涤 加入1ml 75%乙醇(4摄氏度预冷)，轻轻洗涤沉淀,4℃，7500g×5min，弃上清。注意在倒出液体时不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。此步可重复. 8.? 晾干 室温放置晾干（不要晾的过干，RNA 过分干燥后会很难溶解，大约晾干2－3分钟左右，见乳白色沉淀变成透明胶冻状即可） 9.溶解 根据实验需要及得到RNA量的多少，加入30-100 μl 无RNase 水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。 为了保证RNA的浓度在可用范围，可使用20-30μl水溶解。若浓度过大可再稀释。 预防RNase 污染，应注意以下几方面： 1． 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。 2． 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。 3． RNA 在TRNzol 试剂中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除 R