蔗糖酶的分离提纯及酶促.pptVIP

ghy302@163.com 蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验 （综合性大实验） 课件制作、讲授及实验指导：郭慧云 内容提示 本实验含如下内容（1、2、3是酶分离提纯及比活力测定部分的内容；4、5是酶促反应动力学部分的内容）： 1、 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS法）工作曲线的制 作及三种蔗糖酶样品（E1、E2 、E3）的测定（酶活力）； 2、 Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作及三种蔗 糖酶样品（E1、E2 、E3）的测定（蛋白质含量）； 3、蔗糖酶的分离提纯（细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、 透析和离子交换柱层析—装柱、上样、洗柱、洗脱、收 集酶活力峰、保存）； 4、蔗糖酶米氏常数的测定（用双倒数法）； 5、用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响（含实验设 计及数据处理的相关知识）。 一、目的要求 1.熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项； 2.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理和方法； 3.学习掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4.学习酶蛋白分离提纯的原理； 5.学习掌握细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、透析和离子交换柱 层析技术； 6.学习掌握酶的比活力测定及其计算方法； 7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择确 定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法； 8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识：用正交表设计 试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。 二、实验原理 前 言 酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。 酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力）及收率；依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离; 胞内酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分 离、纯化、测活、保存；用测定酶活力的方法跟踪酶的去向、 衡量酶提纯的程度和得率。 酶促反应的动力学（反应速度及影响因素）: 1）底物浓度对酶促反应速度的影响 2）酶浓度对酶促反应速度的影响 3）pH值对酶促反应速度的影响 4）温度对酶促反应速度的影响 5）激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响. 4、Folin-酚法测定蛋白质含量的原理： 1）凡含有两个及两个以上肽键（—CO—NH—）的化合物（如双缩脲：H2N—CO—NH—CO—NH2），在碱性溶液中（如Folin-甲试剂）都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物； 2）蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的，故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应，形成紫色的铜-蛋白质复合物； 3）铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸（Folin-乙试剂）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比； 在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、 Folin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100倍），所以我们选用本方法。 5、有机溶剂分级沉淀的原理： 有机溶剂分级是利用不同Pr在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。 其原理是： 1）有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加Pr分子上不同 电荷的引力，使蛋白质的溶解度下降； 2）有机溶剂与水作用，能破坏Pr的水化膜，使蛋白质的 溶解度下降。 6、离子交换柱层析的原理： 是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技术。在分离过程中，以离子交换作用为主导；在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是： 1）有开放性的长链结构、较大的表面积，所以对Pr 的吸附容量大； 2）纤维素上离子基团的数量不多且排列疏散，对 Pr的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即 可达到分离的目的，不致引起Pr的变性； 3）用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都 不会发生体积的改变，所以有利于Pr的层析。 本实验中使用的DEAE-c11是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。 三、实验流程 周三晚上6：00开始 周四下午1：00开始 1、制备蔗糖酶粗品E1 2、制作DNS比色定糖