蒙古绵羊Bcl-2基因3’端cDNA的克隆及序列分析.pdfVIP

· 28 · 生物技术 中国畜牧兽医 2008年第 35卷第 11期 蒙古绵羊Bcl一2基因3’端 cDNA的克隆及序列分析 郭宏儒 ，曹贵方 ，锡林高娃 (t．内蒙古 民族大学，通辽 028043；2．内蒙古农业大学动物胚胎与发育生物学研究室，呼和浩特 010018) 摘要 ：为扩增蒙古绵羊 Bcl2基 因3’端 ，根据 GenBank上 已公布 的牛的序列，设计 了2条引物 。从蒙古绵羊脾 中提取总 RNA ，采用 RT—PcR技术扩增 出Bcl2的cDNA ，并重组到PMD18一T载体 ，经限制性 内切酶谱分析和 DNA序列测定，证实 所克隆的cDNA为Bcl一2，因为该 cDNA包含 由261个碱基组成 的开放读码框(ORF)，该 ORF编码 83个氨基酸 。经 比对 ，与 牛 的核苷酸序列的同源性为 95．8 。 关键词 ：绵羊 ；Bcl一2基因；克隆；序列分析 ；cDNA 中图分类号 ：Q785 文献标识码 ：A 文章编号 ：1671—7236(2008)11—0028—04 Kerr等 (1972)提出细胞凋亡 的概念 ，细胞凋亡 宝生物工程有限公司；EcoliJM109感受态细胞为 (apoptosis)又谓细胞程序化死亡 (programmedcell 本实验室保存 。 death，PCD)，是一种参与 了生物体许多过程 的细 1．3 PCR 引物 的设计与合成 胞去除机制，是 由基 因编程调控 的细胞主动 自杀过 1．3．1 RT—PCR引物的设计及合成 根据 Gen— 程 。抗凋亡基因Bcl一2家族的发现开辟 了新一类癌 Bank反刍动物 Bcl一2的基因序列 ，利用计算机软件 基 因——凋 亡 调 控 基 因 的新 纪元 (Korsmeyer， DNAStar进行基因序列 的同源 比较得 出Bcl一2cD— 1992)。Bcl一2基 因(即B细胞淋 巴瘤 ／白血病一2基 NA序列的保守区，根据该 cDNA保守区和引物设 因)是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用 ，近年 计原则设计 1对 PCR引物 ，引物 由上海生物工程公 来的一些研究已开始揭示这一作用的机制。目前 已 司合成 。上 游 引物 (P1)：5’一TTCGCCGAGAT— 经发现的Bcl一2蛋 白家族按功能可分为 2类，一类 GTCCAGTC一3’；下游引物 (P2)：5 ATCCCAGC— 是像 Bcl一2一样具有抑制凋亡作用 ，如哺乳动物的 CTCCGTTGTCC 一3’。 Bcl—X1、Bcl—W、Mcl一1、A1、线虫 Ced一9、牛痘病毒 1．3．2 Bcl一2cDNA3’RACE引物 3’RACE用 引 EIB119等，而另一类 具有促进凋亡作用，如 Bax、 物 ：反转录引物 (RT—Primer)为试剂盒提供的 Oligo Bcl—Xs、Bad、Bak、Bik／Nbk、Bid和 Harakiri(Brown， dT—AdaptorPrimer，该 引物含有 TaKaRa独 特设 1996)。 计的 dT 区域及 M13PrimeM4部分 。P3(5’。 1 材料与方法 GTTTTCCCAGTCACGAC一3’)为试剂盒提供 。 1．1 试验材料 蒙古绵羊取 自于 内蒙古穆斯林屠 根据本研究通过 RT—PCR已获得的蒙古绵羊 宰场，取新鲜脾脏液氮保存备用。 Bcl一2的大部分序列和引物设计原则，并借助计算机 1．2 试剂 琼脂糖 、溴乙锭 、总 RNA提取试剂盒 软件 DNAStar进行辅助设计 ，设计了 1条特异性引 (Cat．NO．Z5110)购 自Promega公司。反转录 RT— 物 P4(5’一TCATGTGTGTGGAGAGCCTCAA一3’) PCR试剂盒 (Cat．NO．DRR019A)、PCR产物纯化 作为上游引物，下游引物为 P3。 试剂盒 、限制性内切酶 HindⅢ和