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实验五 根系活力的测定 一、实验目的 1、理解植物根系活力的内涵 2、熟悉测定根系活力的方法及测定原理: 二、实验原理 TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。 在幼根中，脱氢酶活性的强弱与根系活力成正比。所以，通过测定脱氢酶的活性，可由脱氢酶活性代表根系活力。 氯化三苯基四氮唑（TTC）溶于水中为无色溶液，还原后生成稳定、红色、不溶于水的三苯基甲腙 （TTF）。 生成的TTF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化 溶于乙酸乙酯，485nm有最高吸收峰 三、实验材料及用品 实验材料：水培1天葱的根系 实验器皿：分光光度计、水浴锅、研钵、漏斗、移液管、比色皿、容量瓶、烧杯、滤纸 实验溶液：乙酸乙酯、石英砂、硫代硫酸钠（Na2S2O4）、TTC、磷酸缓冲液、硫酸 四、实验步骤 1.制作TTC标准曲线 将配制好的浓度为0,0.01%，0.02%，0.03%，0.04%的TCC溶液，各取5ml放入比色管中，在哥使馆中加入乙酸乙酯5ml和Na2S2O2粉末少量，摇匀→溶液分层，甲腙位于乙酸乙酯层→取上层乙酸乙酯→485nm比色→标准曲线→记录数据。 2.测定根系活力 将根系洗净，搽干表面水分，取0.5g根尖样品（第1份加1mol/L硫酸2ml ）→0.5％TTC溶液5ml→磷酸缓冲液5ml→37℃下保温1h→第2份试管加入1mol/L硫酸2ml，以杀死根系作为空白对照→取出根，洗净，吸干水分→与4 ml乙酸乙酯和少量石英砂在研钵内磨碎 →红色提取液移入试管且用乙酸乙酯定容到10ml→空白试验作参比测485nm下吸光度→根据标准曲线，求四氮唑还原量。 五、实验现象和结果 a、制作标准曲线（显示计算公式及R^2值） 浓度（mg/ml） 1 2 3 4 OD值 0 0.157 0.418 0.820 1.187 表一 各浓度吸光度值记录表 图一 各浓度TTC溶液在485nm下的吸光度曲线图 如图一所示,回归方程为y=303.7x – 0.0910, R^2=0.9735 把样品吸光度0.021nm代入方程可得 x=3.688x10^-4 b、计算TTC还原强度和还原量 四氮唑还原量（ug）=TTC浓度×提取液总体积（×稀释倍数） =3.688 x 10^-4 x 25 =9.22x 10^-3 ug 四氮唑还原量（ug） 四氮唑还原强度（ug/g(根鲜重)/h）= ——————————— [根重（g）×时间(h)] = 9.22x10^3/(0.5x1) =1.844x10^-2 六、分析和讨论 1.在实验中，进行标准曲线制作步骤时，加入Na S O粉末摇匀后为出现红色，可能是由于溶液本身浓度有偏差和操作时加入的溶液有偏差。 2.具有生活力的根在呼吸代谢过程中产生的还原物质能将无色的TTC还原为红色的、且不溶于水的三苯基甲腙，因此在根系活力测定中，产生红色物质，即为甲腙。 七、思考题 1、为什么要以杀死的根系作为空白对照？ 答：在分光光度法实验过程中，样品及标样都加了处理剂，处理剂就可能会含有被测物质，使用空白对照就是去掉除被测物质外所带来的结果误差。 2、R^2值需大于0.99，如不符合，请分析原因。 答:本次实验中的R^2为0.9735，小于0.99，存在这个问题可能是因为溶液配制过程中不够准确,导致存在误差。