01实验一产中性蛋白酶芽孢杆菌的筛选.pptVIP

微生物学实验技术 一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育研究 山东农业大学生命科学学院 微生物学系 2012.8 实验内容 一、产中性蛋白酶芽孢细菌的筛选 二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 三、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定 四、产酶菌株生长曲线的测定 五、菌种保藏技术 实验要求 一、每个实验相对独立，都要提交实验 报告； 二、课程中间进行三次测验考核，不再 进行期末考试； 三、每8人一组，独立完成实验。 实验一 产中性蛋白酶芽孢细菌的筛选 一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献 一、目的意义 1、筛选获得一株高产中性蛋白酶的芽孢细菌菌株。 2、学习掌握从样品采集到菌种保藏的技术流程。 关键技术: 综合实验方案设计 实验准备 样品采集 酪蛋白平板水解圈法初筛 无菌操作 二、材料方法 技术路线 样品采集：选用豆豉等富含蛋白质的自然样品进行筛选。 富集培养：以酪蛋白为唯一碳源富集培养目标菌株。 预处理：80℃水浴10分钟 初筛：水解圈法 复筛：分光光度计法 第一次实验： 讨论并设计实验方案； 实验材料准备：培养基、无菌水等； 样品预处理（5g豆豉，加入45ml无菌水，80℃水浴10分钟处理） 系列稀释涂平板； 37℃倒置培养48h； 酪蛋白筛选固体培养基 酪蛋白：5.0g； 酵母膏：2.0 g； 琼 脂：20.0g； 蒸馏水：1000ml pH: 7.0。 第二次实验： 从第一次实验的平板上，观察选择产生水解圈的菌落，制片镜检观察； 选择水解圈最大的、产芽孢的菌落进行下一步操作； 将水解圈最大的芽孢细菌菌落作为目标物，在LB平板上进行划线分离； 37℃倒置培养24h； LB分离纯化固体培养基 蛋白胨：10.0g； 酵母膏： 5.0 g； 氯化钠：10.0g； 琼 脂：20.0g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。 第三次实验： 挑取生长饱满的单菌落转接入LB试管斜面，每个分离物转接5支试管。 37℃培养24h，保藏备用； 讨论下一步实验方案（紫外线诱变育种）并准备实验材料； LB斜面保藏固体培养基（同纯化培养基） 蛋白胨：10.0g； 酵母膏： 5.0 g； 氯化钠：10.0g； 琼 脂：20.0g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。 三、数据结果 初筛依据： 水解圈直径（D2）：菌落直径（D1） D2/D1 = ？ 复筛依据 Folin -酚法 测定中性蛋白酶活性 四、讨论分析 样品采集 预处理 富集培养 初筛 复筛 评价体系 …… 五、参考文献（举例） [1] 孙妍等，产蛋白酶和纤维素酶纳豆芽孢杆菌益生菌株的 筛选及其生长特性研究，东北农业大学 学报，第42卷 第3期，42（3）：39~42。 [2] 蔡婉玲等，蛋白酶产生菌的筛选和紫外诱变育种，生物 技术，2011年21（1）。 [3] 宋园亮等，元阳豆豉中高产蛋白酶乳酸菌的筛选及其产 酶条件的研究，中国微生态学杂志，2011年1月第23卷 第1期。 [4] 肖峰等，一株产中性蛋白酶海洋细菌的筛选与初步鉴 定，食品与药品 ，2011年第13卷第03期 [5] ……