肾癌的癌旁正常肾组织定量比较蛋白质组学研究--《南方医科大学》2011年博士论文.docVIP

肾癌及癌旁正常肾组织定量比较蛋白质组学研究--《南方医科大学》2011年博士论文 背景与目的 肾癌是泌尿系最为常见的恶性肿瘤之一,大约占成人恶性肿瘤的3%,其发病率仍在不断增高,全世界每年大约有100,000个人死于肾癌。常见病理类型分别有肾透明细胞癌(75%)、乳头状癌(15%)和嫌色细胞癌(5%)。局限性肾癌可以通过手术得到根治,但约30%的患者在术后可出现肿瘤转移。肾癌在诊断时即大约有40%的患者为局部进展期或者晚期,出现转移的患者预后极差,5年生存率低于10%。因对化疗和放射治疗不敏感,目前中晚期肾癌的治疗手段极为有限。近来随着靶向治疗的应用,中晚期肾癌患者的预后有了一定改善,但效果仍然不够理想。缺乏特异性分子标记物用于肾癌早期诊断、筛查以及术后监测和预后判断,寻求更有效的治疗靶点是目前肾癌诊治过程中所面临的难题。本研究采用荧光差异显示双向凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)蛋白质组学方法联合质谱技术筛选并鉴定肾透明细胞癌组织与癌旁正常肾组织差异表达蛋白质,并对感兴趣差异表达蛋白进行验证。探讨肾癌发生发展的分子机制,以期寻找肾癌特异性肿瘤标记物用于肾癌筛查、临床早期诊断及预后判断,为寻找肾癌新的治疗靶点提供依据。 第一章肾癌及癌旁正常肾组织荧光差异显示双向凝胶电泳 1.目的 建立肾癌及癌旁正常肾组织荧光差异显示双向凝胶电泳胶图,分析选取差异表达蛋白质点作为后续质谱鉴定之用。 2.材料和方法 随机选取临床分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肾透明细胞癌患者各5例,15例肾癌及配对癌旁正常肾组织均来自南方医科大学附属南方医院泌尿外科手术患者。肿瘤标本均经病理证实为肾透明细胞癌,癌旁组织为癌灶周围5cm以外正常肾组织,均经病理证实无癌细胞侵润。15对样品按照分期分为3组,每组共5对样品,采用标本混合法,对每组肿瘤及癌旁组织分别进行等量混合,液氮研磨共得6份蛋白质样品,内标为该6份蛋白样品的等量混合。Cy3、Cy5荧光染料分别随机交叉标记不同组肾癌及癌旁组织,Cy2标记内标。每块胶上样总蛋白为Cy3、Cy5标记的肾癌和癌旁组织及Cy2标记的内标,共3块胶,避光行双向电泳。Typhoon 9410扫描仪扫描胶体,Decyder软件分析胶图。采用配对t检验,两组间蛋白含量之比≥1.5倍,P0.05为差异表达蛋白点。考马斯蓝染色制作制备胶,切取差异表达蛋白质点。 3.结果 电泳结束,采用三种不同的波长488 nm (Cy2),532 nm (Cy3),633 nm (Cy5)激光扫描三张胶,共得到9个扫描图谱。Decyder软件分析扫描图谱,从肾癌及癌旁正常肾组织图谱中筛选出35个差异表达蛋白位点,经考马斯蓝染色建立制备胶后找到27个差异蛋白点,作为下一步质谱鉴定蛋白质点。27个差异蛋白点中最大上调比例为7.364,最大下调比例为8.863。 4.结论 本研究应用2D-DIGE蛋白质组学技术平台,首次成功制备了荧光素标记的肾癌组织与癌旁正常肾组织差异显示双向凝胶图谱；建立了定量比较蛋白质组学技术路线,并掌握了蛋白质组学研究的基本方法。为揭示肾癌发病机制、探索肾癌肿瘤标记物提供新的研究思路。 第二章肾癌组织差异表达蛋白点质谱鉴定 1.目的 对2D-DIGE筛选的差异表达蛋白质点进行质谱鉴定,明确差异表达蛋白质的名称并文献检索差异蛋白质的功能。 2.材料和方法 在考染制备胶上找到前述27个相应的差异表达蛋白质点,沿染色边缘切下选定的蛋白点。经脱色及胶内胰蛋白酶消化,提取肽混合物。采用MALDI-TOF MS或串联质谱技术对差异蛋白点进行分析,得到肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF),使用Masort检索程序进行检索(),数据库选择Swiss-Prot, Mascort软件给出蛋白质得分确认质谱鉴定结果。 3.结果 1)27个差异蛋白点共成功鉴定出26种蛋白质。其中11个蛋白质在肾癌组织中表达上调,分别为：加帽蛋白G (CAPG)、纤维蛋白原-β(FIBB)、核苷二磷酸激酶A (NDPK-A)、β-防御素107(D107A)、尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)、膜联蛋白A4(ANXA4)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、α-烯醇化酶(ENOA)、血清白蛋白(ALBU)、微纤维相关糖蛋白4(MFAP4)、磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)。 2)15个蛋白质在肾癌组织中表达下调,分别为：线粒体琥珀酰辅酶A连接酶-β(SUCB1)、甜菜碱-高半胱氨酸S-甲基转移酶2(BHMT2)、甘油-3-磷酸脱氢酶辅酶Ⅰ(GPDA)、酮己糖激酶(KHK)、过氧化物酶-4(PRDX4)、含自水解酶结构域蛋白14B