PCR常见问题汇总.docVIP

PCR常见问题总汇 PCR产物的电泳检测时间48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。PCR失败或扩增条带不 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 　　物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下PCR失败的原因之一。PCR扩增是不会成功的。　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。PCR扩增PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 (93℃变性，65左右退火与延伸)。　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4过夜。2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： /铺板DNA的总量。DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ugpGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生20-40蓝斑