广东地区临床分离结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因变异研究.pdfVIP

rials＆ Resistance 1．2 方法 按全 国结核病诊断细菌学检验规程标准 进行分枝杆菌分离培养 ，分枝杆菌菌种鉴定采用生物 化学反应，药物敏感试验采用 以罗 氏培养基为基础的绝对浓度法 。 1．3 引物设计 引物序列见表1。 表1引物序列 1．4 结核分枝杆菌DNA的制备 用接种环从L—J培养基斜面上刮取结核分枝杆菌菌落 ，加入到300儿 DNA裂解液中，55℃水浴3h， 95℃灭活5min，加等体积 的酚一氯仿一异戊醇 (25：24：1)抽提2次 ，加50儿 高压过 的双蒸水溶 解 ，一20℃保存备用 。 1．5 PCR扩增 采用50 L反应体系，2．5XdNTPS终浓度为0．2mmo1／L，引物终浓度为0．25gmo1／L，扩增程 序为 ：94℃变性5min；94℃变性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸1min；循环30次，最后72℃延 伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶 电泳检测 。 1．6 DNA序列测定与分析 PCR产物交 由上海生工生物工程技术服务有 限公司进行测序 。 2 结果 2．1 从500例广州市胸科医院疑似肺结核病患者的痰液 中分离得到62例结核分枝杆菌 。在本研 究结 果中，4种药的总体耐药情况 ：INH耐药率为56．5％(35／62)、RFP耐药率为43．5 (27／62)、SM耐 药率为40．3％ (25／62)。在耐单一药物中，以耐异烟肼为首位 。INH、RFP、SM高浓度耐药分别为 13／35 (37．1％)、19／27 (70．3％)、22／25 (88％)。结果见表2。 表2 62例临床分离 的突变情况总结 i {{ _÷il 《 镑||％§％％％l∞ii§I§《《《I15Illli5：：l：l％§§R《德#l《《i。g‘l≈i镕≈魏黪％#《《女§§^§l§《％t☆‰ 2．2 KatG基因与MTB异烟肼耐药 频 率 最 高 ，且 以高度 耐 药 为 主 。22株 发 生 氨 35株 INH耐药株 中，低度耐药率为81．8％ 基酸 突变 ，5株 (18．5％)未发生突变 ，rpoB基 (18／22)和 高度耐药率为7／13 (53．8％)， 因突变率 为81．5％。TCG—TTG (Ser—Leu) ( 一2．95，得P0．05) ，2组之 间差异无 在 53l位 点突变 15株 (55．6％)；CAC—cTc 统计学意义 。在35株 INH耐药株 中，有25株发 (HiS—Leu)在526位 点突变6株 (22．2％)； 生katG基 因突变 ，kat基 因突变率为81．0％。 CTG—CCG (Leu—Pro)在 533位 点 突变 1株 AGc—ACC (Ser—Yhr)在 315位 点突变20株 (3．7％)。见表3。 (57．1％) ；AGC—GGC (Ser—G1Y)在315位 2．4 s 基因与MTB~U福平耐药 点突变 1株 (2．9％)；CTG—CCG (Arg—Leu) 25株SM耐药株 中，低度 耐药株 的66．7％ 在 463位 点突 变 4株 (11．4％) 。有 l0株 (2／3)和高度耐药株 的77．3％(17／22)。高低 (28．5％)未发生基因突变 。见表3。 浓度两组之 间差异无统计学意义 ( =0．05， 2．3 rOoB基因与MTB~U福平耐药 得P0．O5)。19株发生，pSL基 因突变 ，6株 27株RFP耐药株 中，低度耐药率为29．6％ (24％)未发生基 因突变 。 psL基 因突变率为 (8／27)和 高度 耐药 率为 70．3