无机-有机聚合物整体柱的制备及其在蛋白分离方面及应用.pdfVIP

2010年9月环渤海第一届暨天津市第十九届色谱学术报告会-仪器展览会文集 无机一有机聚合物整体柱的制备及其 在蛋白分离方面的应用 2 杨更亮1’2程佳1～，白立改1t (1．河北省药物质量研究与控制重点实验室，河北，保定，071002；2．河北大学药学院，河北。保定，071002) 色谱分析是目前最为活跃的分析化学分支学科之一，无论从技术到理论，到各种分离模 式，还是在各个科学领域内的应用都得到了突飞猛进的进展。高效液相色谱作为一种有效的 分离手段，在生物技术产品的制备中发挥着十分重要的作用。在整个高校液相色谱分析体系 中，色谱柱是整个色谱系统的核心。而聚合物整体柱制备方法简单，具有高机械强度，高渗 透性，可以对生物大分子进行快速、高效、高通量分离分析，作为一种新型分离介质，正朝 着品种多样化、性能高效化的方向发展。在本研究中，一个基于原子转移自由基聚合【l-2】的 新的无机．有机聚合物整体柱被成功研制，并且成功用于蛋清中卵白蛋白的分离。 1 实验部分 1．1仪器与试剂 1100)：UV-1100紫外可变波长检测器，真空在线脱气 高效液相色谱系统(美国Agilent 机，四元泵，进样器：Agilent化学工作站；SZ．97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器 rSHIMADZU)。 甲基丙烯酸缩水甘油酯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，十二醇、甲醇、氯化亚铁、四氯化碳 (天津市科密欧化学试剂有限公司)；所有试剂均为分析纯，实验中所用水均为三次蒸馏水。 所有溶液及流动相进入色谱系统前均经过O．45岬微孔滤膜过滤。 1．2聚合物整体柱的制备 将甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、四氯化碳、十二醇、氯化亚铁按一 定比例加入试管中。超声30分钟使之混匀。装入不锈钢空色谱柱管，两端密封，于60℃的 超级恒温水浴中加热24h。反应结束后除去密封端，连接上柱头将其接于高效液相色谱泵上， 用甲醇将致孔剂和未反应的试剂冲出即得到无机．有机复合物整体柱。 1．3样品的制备 1．3．1标准品的制备 精密称取1．0 mg卵白蛋白，用超纯水溶解使标准品浓度达到1．0mg／ml。 1．3．2实际样品的制备 选用从超市购买的新鲜鸡蛋，从中得到鸡卵清。将鸡蛋清用磷酸缓冲液以1：4的体积比 稀释。然后超声波处理，并不断加入氯化钠至其浓度达No．5moFL。最后将该溶液在4C下 以10000 min，上清液冷藏保存备用。 rpm离-C,30 1．4整体柱的柱效 色谱介质的柱效和柱体均匀性可以用理论塔板高度(HETP)来评价。实验分别选用BS～2 mM mg／mL)作为探针分子，10Tris．HCl，pH=7．6的缓冲液作为流动相，将色谱柱平衡后， 用20皿的进样器进样。利用探针分子在非保留条件下进样，通过积分法计算得到HETP值。 理论塔板高度(HETP){=t算公式【3J： 基金项目：国家自然科学基金资助项目20675084) 作者简介：杨更亮(1963)，男，河北人，教授，博士生导师．tel：0312·5971105：cmail：yrJ@hb_Leda．m 45 2010年9月环渤海第一届暨无津市第十九届色谱学术报告会-倥器展览会文集 HETP：坐曼 ㈩ “2 其中，HETP．．色谱梓的扳高(mm)：L--色谱桂长(mm)；a2～二阶中心矩：…一阶原点矩 口：：坚!￡丝 (2) j c(t)dt “：—Itc(—t)dt (3) J c(t)dt ji中，卜时间(5J：c(t卜色谱枉山口端洗脱渣浓度(m咖L)。 1 5色谱条件的确定 通过实螗来确定分离卵匀蛋白的富集流动相与洗脱流动相。然后在通