猪圆环病毒2型Cap蛋白ELISA检测方法的建立及初步应用.pdfVIP

猪圆环病毒2型cap蛋白ELISA检测方法的建立及初步应用 廖园园’，朱薇，李建，王威，秦伟，漆世华，李晶梅，谢红玲，温文生，吴玉石 (武汉中博生物股份有限公司，湖北武汉430070) 摘要：将杆状病毒表达系统表达并经梯度离心纯化的PCV2Cap蛋白作为标准品，利用双抗夹心法建立了针对猪圆环 病毒2型抗原的检测方法，并应用于圆环病毒2型基因工程疫苗的质控。结果表明，多抗最适包被浓度为l肛g／ml，最佳封闭 Sf9细胞、BSA和其它猪病病毒抗原之间无交叉反应，最低检测抗原量为5ng。 关键词：猪圆环病毒2型，衣壳蛋白Cap，ELISA，抗原检测，夹心法 circovirus 猪圆环病毒2型(Porcine type2，PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征 (Postweaningmultisystemicwasting 有4个抗原表位，具有较好的免疫原性和抗原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原表位，也是现在 基因工程疫苗研究的热点蛋白。为建立一种敏感、特异、快速的猪圆环病毒2型抗原检测方法，使PCV2基 Cap蛋白的方法，并初步 因工程苗的质控更快更准更方便，本研究利用双抗体夹心法建立了一种检测PCV2 应用于猪圆环病毒2型亚单位基因工程疫苗的质量检测。 1材料和方法 1．1材料 自国药集团化学试剂公司分析纯。其他主要设备有：包被机，洗板机，酶标仪，恒温孵育箱。 1．1．2PCV2 染Sf9细胞，收获表达的Cap蛋白，通过CsCl密度梯度离心纯化后作为检测的抗原标准品。 1．1．3 PCV2多抗和单抗的制备PCV2 测效价达1：1000以上，即可采血分离血清。分离的血清通过辛酸一硫酸铵沉淀法进行纯化获得所需抗PCV2 抗原纯化多抗。 应用杂交瘤技术制备单抗，PCV2Cap蛋白常规免疫BALB／c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，将脾脏细 疫荧光)方法鉴定抗PCV2的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆化晗1后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞 株，通过小鼠腹水生产抗PCV2的单克隆抗体，通过辛酸一硫酸铵沉淀法将腹水进行纯化，获得的既为所需 抗PCV2单克隆抗体。 1．2ELISA方法的建立 1．2．1最佳抗体包被浓度、单抗使用浓度和二抗使用浓度的确立按照方阵滴定方法优化ELISA反应条件。 +作者简介：廖园园．硕士，从事动物病毒体外诊断试剂的研究工作。E-maiharnyylll@163．corn ·__——765‘__—— 第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 50I．tl／孔，终止 反应，于酶标仪450 5％脱脂乳、2％明胶H。及1％BSA+0．5％酪蛋白的PBST200肛1／孔，37℃封闭2h，抗原标准品按1．2．1方 闭液。 1．2．3封闭时间的选择以最佳多抗浓度包被酶标板，洗涤，用确定的封闭液200Pl／孔，分成3组，分别 h，37℃3h，4℃24 为37℃封闭1h，37℃2 h。封闭后，抗原标准品按1．2．1方法稀释，进行ELISA测 定，其他步骤同1．2．1。比较各组阴、阳性样品的0D值和P／N值，以选择合适的封闭时间。 1．2．4单抗反应时间的确定酶标板按照确定的条件包被和封闭后，抗原标准品按1．2．1方法稀释，进行 品的0D值和P／N值，以选择最佳单抗反应时间。 1．2．5酶标二抗反应时间的确定酶标板按照确定的条件包被和封闭后，抗原标准品按1．2．1方法稀释， 阴、阳性样品的0D值和P／N值，以选择最佳酶标二抗反应时间。 照。 1．2．7重复性试验取3个不同批次的试剂盒分别检测PCV2基因工程苗样品和阴性细胞样品，每份样品重 复检测4次，计算批内及批间变异系数(C．V)。 因工程疫苗进行检测，比较结果。 2 结果 2．1最佳抗体包被浓度、单抗使用浓度和二抗使用浓度的确立 方阵试验如表1所示，相关系数(y)值越高标准误(s)值越低的组别，包被条件和单抗及二抗浓度 表1 ELISA方阵滴定