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α-甘露糖苷酶基因RNA干扰果实软化N-聚糖论文 【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】α-甘露糖苷酶(α-mannosidase, α-man)是植物细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶,在植物果实发育成熟过程中起着重要的作用。本研究以呼吸跃变型甜瓜品种河套蜜瓜为研究对象,利用RT-PCR技术从甜瓜果实中克隆得到甜瓜α-甘露糖苷酶基因cDNA片段,并构建了RNAi表达载体pART27-α-man,通过花粉管通道法转化甜瓜,获得了大量T0转化种子。从每份T0转化种子中随机选取12粒种子,播种于育苗盘内,进行PCR检测,选取阳性率高的T0转化种子,播种于大田,经果实耐贮藏表型筛选,获得了耐贮性强的T。代转pART27-α-man果实24个,采集T1转化种子。从每个株系中随机选取12粒T1种子,播种于育苗盘,进行PCR检测,获得PCR检测阳性株系10个。选取2个株系,将T,种子种植于日光温室,获得T,果实及T2种子。结果表明转α-man RNAi载体的甜瓜果实耐贮藏性和货架期明显延长,初步表明α-man基因在甜瓜果实成熟衰老过程中发挥重要作用。 【关键词】甜瓜；α-甘露糖苷酶基因；RNA干扰；果实软化；N-聚糖； 【篇名】甜瓜α-甘露糖苷酶基因cDNA片段的克隆、RNAi载体构建及转化 【目录】甜瓜α-甘露糖苷酶基因cDNA片段的克隆、RNAi载体构建及转化 摘要 4-5 ABSTRACT 5-6 英文缩写及中英文对照表 9-10 1 引言 10-23 1.1 α-甘露糖苷酶概况 10-13 1.2 α-甘露糖苷酶及其基因的研究现状 13-17 1.2.1 动物α-甘露糖苷酶及其基因的研究现状 13-15 1.2.2 植物α-甘露糖苷酶及其基因的研究现状 15-17 1.3 转基因甜瓜的研究概况 17-23 1.3.1 甜瓜转基因方法 17-21 1.3.2 转基因耐贮藏甜瓜研究进展 21-23 1.4 研究的目的与意义 23 2 实验材料与方法 23-38 2.1 实验材料 24 2.1.1 植物材料 24 2.1.2 菌种与质粒 24 2.1.3 主要试剂 24 2.2 实验方法 24-38 2.2.1 引物设计和合成 24-25 2.2.2 α-Man cDNA片段的克隆 25-28 2.2.3 α-Man RNAi中间载体的构建 28-32 2.2.4 α-Man RNAi表达载体的构建 32-34 2.2.5 花粉管通道法转化河套蜜瓜 34-35 2.2.6 T_0转化植株的检测 35-36 2.2.7 T_1代转基因耐贮藏甜瓜株系的筛选 36-37 2.2.8 T_2代转基因耐贮藏甜瓜植株检测 37-38 3. 结果与分析 38-54 3.1 cDNA克隆 38-43 3.1.1 RNA的分析 38 3.1.2 RT-PCR产物分析 38-39 3.1.3 克隆载体重组质粒的筛选 39 3.1.4 菌落PCR检测 39-40 3.1.5 α-Man cDNA片段序列分析 40-43 3.2 RNAi中间载体构建 43-46 3.2.1 目的片段PCR产物分析 43 3.2.2 正向片段重组质粒的筛选 43-44 3.2.3 菌落PCR检测 44 3.2.4 酶切鉴定 44 3.2.5 反向片段重组质粒的筛选 44-45 3.2.6 菌落PCR检测 45 3.2.7 酶切鉴定 45-46 3.3 RNAi表达载体构建 46-47 3.3.1 表达载体的筛选 46 3.3.2 菌落PCR检测 46-47 3.3.3 酶切鉴定 47 3.4 T_0代植株检测 47-49 3.5 T_0代转基因耐贮藏甜瓜植株的筛选 49-50 3.6 T_1转基因甜瓜植株PCR检测 50-52 3.7 T_2代转基因耐贮藏甜瓜株系的获得 52-54 4. 讨论 54 5. 结论 54-55 参考文献 55-64 致谢 64