甲型流感病毒NS1蛋白人CPSF30结合拮抗剂酵母荧光筛选模型的构建初步应用.pdfVIP

构建与初步应用 孔建强牵，史彦薇，王志芳，王伟，程克棣 (天然药物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院，北京协和医学院药物研究所，北京 100050) 黄连口服液，发现双黄连口服液能抑制NSl和CPSF30的相互作用。 关键词：HINl流感病毒；非结构蛋白NSI；CPSF30；双分子荧光互补；酵母模型 组成，目前研究认为NSl蛋白至少有2个功能区，即RNA结合区(RNAbindingdomain，RBD)比。和效应区 (effectordomain)∞q1。NSl蛋白是个多功能的结构蛋白，在病毒感染早期发挥作用。其主要功能表现在： 抑制宿主细胞抗病毒蛋白的形成幅一“：诱导细胞凋亡喁。1引以及拮抗干扰素的产生uH引。其中，NSl蛋白主要通 过两种途径来抑制宿主蛋白的合成。其一，通过RNA结合区与异源RNA结合而影响宿主基因的转录及转录后 SnRNA、病毒RNA、病毒mRNA5’端非翻译区和dsRNA临1。其二， 加工过程。异源RNA包括mRNA的Poly(A)、U6 NSIA蛋白能与宿主的多种蛋白直接相互作用，并产生生理活性，在转录、转录后加工及翻译水平上影响宿 and polyadenylationspecificity 了宿主蛋白的pre-mRNA3’端的剪切、多聚腺苷酸化和mRNA核输出，从而抑制宿主蛋白的合成。为了直 接证明CPSF 体的重组毒株。结果表明重组病毒株的复制能力大大减弱，提示NSl蛋白上的CPSF30结合位点对于流感病 毒的有效复制是必不可少的。此外，他们还用这株NSl突变株去感染GRE细胞，结果显示用突变株感染的细 胞内抗病毒活性的前mRNA转录后处理的抑制作用减弱。因此感染细胞内具有抗病毒活性的mRNA能够产生 有影响m1。这些试验均表明，NSl上的CPSF30结合位点有可能成为一个靶点。 fluorescence 双分子荧光互补技术(bimolecular 体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术“5。171。其本质上是一种蛋白质片段互补技术，是指将荧光蛋 白多肽链在某些不保守的氨基酸处切开，形成不发荧光的N一和c一末端2个多肽片段。将这2个荧光蛋白片段 分别连接到1对能相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质 的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子， 结合拮抗剂筛选的酵母荧光模型，筛选能拮抗NSl和CPSF30结合的化合物。 +国家自然科学基金和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2010ZD04)资助。 通讯作者：孔建强，jianqiangk@imm．ac．cn ——207 1材料和方法 菌种和试剂 KOD PCR Kit AdvantageCloningw／Cloning 公司；其他试剂都是分析纯。 大肠杆菌在不加抗生素的LB培养基(10gl～Bacto—Tryptone，5l—Bacto-yeastextract，10gl。1 g NaCl)中进行培养，转化菌株的选择在加有100 Pg·mL。1氨苄青霉素的LB中进行。 YPD培养基(i0 extract；10 g·L-lyeast g·L～Bactopeptone：20g·L～glucose；固体培养基添 extract；i0 加2％的琼脂粉)用于酵母的培养；YPG培养基(10g·L～yeast g·L_lBactopeptone；20g·L_l galactose)用于酵母的诱导表达；SDdropout培养基(7g·L‘1yeastnitrogenbase：2g·L～dr