基因测序技术在猪蓝耳病防控中应用.pdfVIP

，、 《：渤论文集 规模猪场使用伊维菌素针剂后，对猪体表寄生虫有很好的防治效果，母猪体表基本无寄生虫感 染，不仪减少员工的工作量，同时提高母猪繁殖指数和动物福利，在良圻EZ种猪场增加效益达76．5 万元，此项措施值得在规模猪场进行尝试。 基因测序技术在猪蓝耳病防控中的应用 伍少钦曹玉美陆江蒙春宁肖有恩 7) (广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场南宁横县53031 摘要：2010年对公司历年保存的PRRSV阳性血清和部分问题猪经RT-PCR检出阳性血清，先后送样8次共62个样品， 成功测序59个，用DNAStar剪切出完整的ORF5序列，进行基因比对和进化树分析，发现核苷酸置换率为58％，同 源性从94．7％～100％不等，整体分化成两大类；PRRSV表现出明显的区域性和时间性，各个商品猪场间的序列均有 ATP和RespPRRSMLV比对，发现公司商品猪场近4年流行的PRRS毒株与HuN4-FI12、JXAI比较接近，表明日前流行 的PRRSV以变异株为主。 关键词：猪；蓝耳病；ORF5；基因测序；进化树 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的 降解法。这两种方法在原理上差异很大，但都足根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特 定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电 泳进行检测，从而获得DNA序列。DNA测序技术的目的：测定未知序列；确定重组DNA的方向与结 构；对突变进行定位和鉴定；比较研究。 PCR检测技术在上世纪90年代已经应用在动物疾病的检测中，但由于成本较高，检测量相对较 少。2005年后，PCR和RT-PCR技术在养殖动物的疫病检测中开始普及应用。基因测序技术，由于早 期成本高，仅限于少数科研院校，近年来随着测序成本的大幅下降，近一两年来国内部分规模养殖 场开始应用这项技术，尤其以研究猪蓝耳病病毒的演变进化最为常见，测序技术在PRRS的控制与净 化中显示出其独到之处。 270 l艘◆l 筮盍届全国猛厶工攫植基毽丝盛盟过金鳖誓 1材料与方法 1．1仪器与试剂 1．1．1仪器：TakaraTP600、英国UVI凝胶成像系统、HettichMIKRO 22R冷冻离心机、北京六一 电流仪和水平电泳槽、净化操作台等。 1．1．2试剂：Taq酶、M-MLV、RNA酶抑制剂、Trizol、DNAMaker等。 1．1．3引物合成与测序公司：上海英骏生物技术有限公司广州分公司。 1．2方法 1．2．1用常规RT-PCR方法检测出PRRSV阳性的样品。 1．2．2样品经克隆或经PCR大量扩增后送测序公司进行测序。 1．2．3用DNAStarLasergene7．1进行序列分析，比对各个样品的测序结果，并制作PRRSVORF5的 演变进化树。 2结果与分析 2．1全部检测结果与分析 进行整体ORF5比对，发现核苷酸置换率为58％，两两相互比对，同源性从94．7％～100％不等，整体 分化成两大类；PRRSV表现出比较明显的区域性和时问性；各猪场的序列相对都有所不同，不同的 ATP和RespPRRS 比较接近，说明目前流行的以变异株为主(详见表1)。 表1商品猪场59个样品与市面疫苗ORF5同源性比较 疫苗毒株名 最小相似 最大相似 疫苗毒株名 最小相似 最大相似 (％) (％) (％) (％) 88．20 89．OO lvac 89．20 90．80 RespPRRS儿V Inge