植物总RNA的提取及RT-PCR.docVIP

植物总RNA的提取 一、实验目的 学习从植物组织中提取RNA的方法二、实验原理 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 三、仪器、药品与试剂配方 (一)?仪器 1．?低温离心机．琼脂糖胶电泳系统．?高压灭菌锅．?研钵一次性手套等(二)?药品 1.?焦碳酸二乙酯(DEPC) .?异硫氰酸胍.?醋酸钠(NaAc) .?苯酚.?异丙醇.?氯仿乙醇.?琼脂糖 (三)?试剂配 1．?0.1%?DEPC水 2.? 4?mol/L异硫氰酸胍2?mol/L?NaAc （pH 4.8） 灭菌 4. 3?mol/L?NaAc （pH 4.8） 灭菌 5. 4?mol/L?LiCl 灭菌 6. 1×TE缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH8.0），1 mM EDTA（pH8.0）, 灭菌。 四、实验步骤 （一）?总RNA的提取?l的4M GT的1.5 ml的聚丙烯管中，摇匀。 加入30 ?l 2 M NaAc（pH4.9-5.2）摇匀，加入300 ?l酸酚（水饱和酚pH5.0）?l三氯甲烷，摇匀。 12000 rpm 4℃离心20 min，吸取上清，加入等体积异丙醇，于冰上放置15 min。 12000 rpm 4℃离心10 min，将沉淀悬浮于含100 ?l 4M氯化锂的1.5 ml EP管中，于-20℃放置1小时或更长时间。 12000 rpm 4℃离心10-15 min，将沉淀溶于0.4 ml DEPC水中，加入1/2体积氯仿和1/2体积酸酚，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min；上清加入等体积氯仿，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min。 上清液加入1/10体积的3 M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇于-20℃放置1小时或更长时间。 12000 rpm 4℃离心15 min，超净台吹干，沉淀溶于10 ?l b灭菌的DEPC水中。 RNA贮于-80℃。 （二）RNA反转录产生cDNA 在DEPC处理过的离心管中冰上按下表加入： 模板RNA 2 μl Olig(dT)18 1 μl DEPC 水 2 μl 混匀，70℃水浴中放置2 min，立即放置到冰上2 min。然后在冰上依次加入： RNasin 0.5 μl M－MLV 5×buffer 10 mM dNTP 1 μl 2 μl 1.5 μl 42℃，水浴中反应90 min。72℃，10 min，终止反应。 加入15 μl的DEPC灭菌水，使总体积达到25 μl。 (三) PCR 1. 在灭菌的PCR管中加入以下成分，形成PCR反应体系 10 X buffer 2.5 μl dNTP (2.5 mmol) 2 μl RT-PCR产物 5 μl Taq酶 0.5 μl 上游引物（10 μmol/l） 0.5 μl 下游引物（10 μmol/l） 0.5 μl 灭菌ddH2O加到25 μl 2. 按照下列条件进行PCR反应 94℃ 5 min 94℃ 30 s 55℃ 30 s 72℃ 1 min 30个循环 72℃ 7 min 4℃ （四）电泳检测 将EB的1 %变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1×电泳缓冲液，覆盖凝胶约1?mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中，5?V条件下电泳30?min，在紫外灯下观察 五、注意事项 1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。 2．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。 3