重组质粒的构建.docVIP

目录 实验流程 2 实验操作 3 1.LB液体培养基的配置 3 2.质粒的提取 4 3.琼脂糖凝胶电泳 5 4.PCR 6 5.DNA片段的回收纯化 ...................................................................7 6.目的片段与载体连接及转化...........................................................8 7.菌种保藏…………………………………………………………...9 8.双酶切反应 ..10 实验流程——质粒构建 实验操作 1．LB液体培养基的配置 【器材】 锥形瓶，烧杯，量筒，分析天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，棉花，报纸，记号笔，麻绳，纱布等。 【试剂】 酵母提取物(Yeast Extract) ，胰蛋白胨（Tryptone)，NaCl 【实验步骤】 1. LB液体培养基配方（配置1L培养基）： 胰蛋白胨（Tryptone) 10g 酵母提取物(Yeast Extract) 5g NaCl 10g 若配置50ml培养基，按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物：0.25g、胰蛋白胨： 0.5g、NaCl:0.5g放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。 2．溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的单蒸水，用药匙搅匀。待药品完全溶解后，倒入50ml 量筒中，补充水分到50ml，倒入锥形瓶中。 包扎 用棉塞或纱布封住瓶口，再在棉塞外包一层报纸，用绳子以活结形式捆扎好。用记号 笔注明培养基名称、组别、日期。 4. 灭菌 将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4°冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干。烘干后，4°保存。 【注】1. 烧杯、量筒、锥形瓶应先用洗涤精洗干净，再用单蒸水润洗。 2. 灭菌后应立即放入烘箱烘干。 3. 培养基存放时间不宜过长。 2．质粒的提取 【器材】 加样枪、灭菌的Tip头、灭菌的Ep管、离心机 【试剂】 灭菌水、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 【实验步骤】 第一次使用本试剂盒时，请将 RNase A1混浊液全部加入到SolutionⅠ中，均匀混合后4℃保存。 实验操作前请将 Solution Ⅲ置于 4℃（或冰上）预冷后使用。 1. 大肠杆菌的培养。 从平板培养基上挑选单菌落接种至 1～4 ml 的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。 注）培养液不宜过量，培养液过量时，会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。 2. 取菌液，12,000 rpm离心2分钟，弃上清。 3. 用 250 μl 的 Solution Ⅰ（含 RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。 4.加入 250 μl 的 Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合 5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。 注）此步骤不宜超过 5 分钟。 5. 加入 400 μl的 4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合 5～6 次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置5分钟。 6. 室温 12,000 rpm 离心 10 分钟，取上清。 注）此时 4℃离心不利于沉淀沉降。 7. 将试剂盒中的Spin Column 安置于 Collection Tube 上。 8. 将上述操作 6 的上清液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 9. 将 500 μl 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。 10. 将 700 μl 的 Rinse B 加入 Spin