肠道菌群细菌鉴定.docVIP

肠道菌群细菌的鉴定 一、实验目的 1.掌握革兰染色法。 2.掌握IMViC试验。 二、仪器与试剂 玻片，接种环，生理盐水，酒精灯，结晶紫溶液，卢戈氏染液，石炭酸-复红溶液，沙黄液，光学显微镜，二甲基氨基苯甲醛试剂，葡萄糖蛋白胨水培养基，甲基红试剂（甲基红0.02g，95%酒精60mL，蒸馏水40mL），6%α-萘酚酒精溶液，40% KOH，铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源的培养基，层析滤纸，正丁醇，甲酸，1.5%乳酸，1.5%乙酸溶液，3%溴甲酚蓝酒精溶液，层析缸，需氧血琼脂平板，厌氧血琼脂平板，七叶苷培养基，胆汁七叶苷培养基，65g/L NaCl血清肉汤，PYR试剂，DNA琼脂平板，1 mol/L盐酸，MRS培养基，X-Gal。 三、实验步骤 1.革兰染色法 （1）涂片：取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握培养皿，右手持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取培养细菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。 （2）干燥：目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然 干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。 （3）固定：手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。? （4）初染：将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。 （5）媒染：加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。 （6）脱色：在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。 （7）复染： 用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。 （8）光学显微镜下观察细菌染色情况 （9）G+菌被染成紫色；G-菌被染成红色。? 2.大肠杆菌 （1）革兰染色法 实验结果应为被染成红色，即G-菌。? （2）IMViC试验 靛基质（吲哚）试验 斑点试验法：将一片滤纸放在培养皿的盖子上或一张载玻片上，滴加1~1.5mL二甲基氨基苯甲醛试剂液于滤纸上使其变湿，取18~24h琼脂平板培养物涂布于浸湿的滤纸上，在1~3min内观察。棕色的试剂由紫红变为红色者即为阳性。 甲基红（MR）试验：取一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48~72h，取出后加甲基红试剂3~5滴，立即观察结果。如果培养液呈红色者为阳性，橙色者为可疑，黄色者为阴性。 二乙酰（V-P）试验：将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基后，于35~37℃培养48h，于2mL培养液内加入甲液（6%α-萘酚酒精溶液）1mL和乙液（40% KOH）0.4mL，摇振混合。试验时强阳性者约于5min后，可产生粉红色反应。如长时间无反应，置室温过夜，次日不变者为阴性。 枸橼酸盐利用试验：将被检细菌少量接种到培养基（铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源）中，37℃培养2~4d，观察培养基颜色变化。培养基变蓝色，阳性；不变，阴性。 实验结果应分别为：阳性，阳性，阴性，阴性。 3.乳酸杆菌 （1）革兰染色法 实验结果应为被染成紫色，即G+菌。? （2）乳酸纸层析法 层析滤纸的制备——将层析滤纸剪成1.5cm*11cm的长条状，在距层析纸一端约4cm处用铅笔划线确定点阳线，使用前充分干燥。 配制展开剂——正丁醇:甲酸:水=80:15:5 配制标准液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液。 制备待测样品——将培养基菌种加入生理盐水37℃培养24h后离心，收集上清液离心，收集上清液。 点样——用毛细管分别吸取发酵液，多次点样于滤纸条上，样点直径不宜超过2mm，平衡2h 层析——将点好样的层析纸放入，使点有样品的一端浸在展开剂中，但不可浸及样点。观察展开情况，待展开剂前沿到达离层析纸另一端约1.5cm处，取出层析纸。 显色——以3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸喷洒并计算Rf值。 实验结果Rf值应该一致。 4.脆弱拟杆菌 耐氧试验 从每个琼脂平板上挑取4~5 个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2 块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板(每个琼脂平板可划4~6 区，每区种一个可疑菌落) ，然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。 实验结