应用低温电镜和三维重构技术研究二十面体植物病毒的三维结构.pdfVIP

62 植物病理学研究进展(第五卷) 应用低温电镜及三维重构技术研究 二十面体植物病毒的三维结构。 王卫兵洪健周雪平 (浙江大学生物技术研究所，杭州31(XY29) 植物病毒按其形态结构的对称性可分为等轴对称的二十面体粒子，螺旋对称的杆状、线 状粒子以及复合对称的杆菌状、弹状、双联体粒子等【1．2J，透射电子显微镜是研究病毒形态 结构的最主要工具。由于生物材料大多由轻元素组成，对电子的散射能力低，图像反差很 弱，必须通过染色或金属投影等方法增大样品的电子密度，得到形态图像。Home等建立的 负染碳膜法制备二十面体病毒二维晶体样品[3．4]，用电子衍射和光学衍射技术研究其三维 结构，也是以负染色的二维拟晶排列粒子为基础。由于重金属颗粒或染色剂对试样的覆盖 作用，使像的细节模糊，结构往往失真而局限于低分辨率水平，同时由于电子辐射对生物材 料的损伤以及生物材料在高真空环境发生的强烈脱水作用，使三维结构严重畸变，因而很难 mi— (如病毒)的三维空间结构测定成为了现实。 1 低温电镜及三维重构技术的原理 为了解决生物材料的电子辐射损伤和脱水作用，欧美一些研究者提出了一种新的样品 制备方法——冰包埋术，它是将生物样品在含水的自然状态下，以极高的速率(1040C／s) 冷冻至液氮或液氦温度，样品悬液薄层就可以形成无定形冰，即不含任何晶体结构的玻璃态 冰，非晶体的冰不会损伤样品。当病毒等大分子悬液滴在有许多微米级孔的微筛膜上时，冷 冻后在这些小孔中就形成厚约20nm的薄冰，包埋和保护着病毒颗粒。低温下电镜观察时， 病毒结构得到瞬时冷冻固定，保持着完全的自然状态，且不会被干燥。同时，冷冻样品对电 子辐射的承受能力可增加一个数量级，大大减少了辐射损伤，就可以保存接近天然状态的蛋 白质大分子结构和化学组成，从而获得高分辨率的结构数据。 在通过低温电镜术获得高分辨率的结构数据之后，要用数学的方法来重构病毒颗粒的 行三维重构的基本原理和方法，并用T4噬菌体尾部为材料获得了第一个三维密度图。三维 重构的基础是中央截面定理，即一个物体二维投影的二维傅立叶变换与该物体三维傅立叶 变换中过原点的截面相等。电子显微镜具有较大的焦深，因此一个物体的电子显微像就是 该物体在与电子束行进方向垂直的平面上的投影。根据中心截面定理可知，当各方向上的 病毒颗粒二维投影足够多时，就可获得该病毒三维傅立叶变换方向的足够多的中央截面，就 可合成该病毒的三维傅立叶变换，通过反变换就获得该病毒的三维结构。这就是说，利用电 ·基金项目：浙江省分析测试基金资助项目。 植物病理学研究进展(第五卷) 子显微术获得病毒颗粒的图像，可通过计算方法获得它们的三维密度分布，再结合生物化学 分析获得的化学组分和低级结构数据，即可分析病毒颗粒的空间结构。病毒颗粒越多，分辨 率就越高。在实际计算中，常缺乏很好的富氏空间数据内插法，所用的三维重构方法并非直 接反傅氏变换，而用傅立叶一贝塞尔合成法。 在具体研究二十面体病毒时，首先要得到高度纯化和浓缩的病毒样品(15rng／m1)，用覆 盖有微筛支持膜的电镜铜网沾取样品后，用滤纸吸掉余液，使样品在微筛孔上形成薄膜；将 铜网迅速浸入以液氮冷却的液体乙烷中，含有病毒颗粒的样品立即成为玻璃态冰，保持着被 冻前的自然状态。然后用特制的低温冷冻转移装置(GatanCryo—transfer System)将样品保持 在100—120K左右，转移到透射电镜的冷冻样品台上，在计算机控制下进行低剂量电子束曝 光成像，记录尽可能多的病毒颗粒。为了确定病毒颗粒对电子束的取向和中心位置，需得同 时拍摄不同欠焦量的一对照片，大欠焦量的照片用于病毒颗粒取向，小欠焦量的照片数据用 于三维重构。将经过挑选的照片用显微光密度计进行数字化，收集结构数据。然后通过专 用的计算机程序根据病毒的二十面体对称性，用等价线(e,xnnnaline)或非等价线方法确定 电子显微像中每一病毒颗粒的投影取向和中心位置，通过反傅立叶或傅立叶一贝塞尔 的三维重构[6】。 2低温电镜及三维重构